Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

[Narrador] Este protocolo incorpora técnicas asépticas en métodos de siembra utilizados para aislar, propagar o enumerar microorganismos como bacterias y fagos. Los procedimientos incluyen la siembra por estrías de cultivos bacterianos para aislar colonias individuales, la siembra por vertido para determinar la concentración de bacterias y la siembra por extensión para enumerar colonias bacterianas viables. Se utilizan capas delgadas de agar para aislar fagos y enumerar placas, mientras que la siembra por replica permite transferir células de una placa a otra manteniendo un patrón espacial idéntico. En última instancia, las aplicaciones prácticas de estas técnicas para el cultivo de microorganismos abarcan desde la identificación de bacterias en ambientes hasta avances tecnológicos en genética molecular y bioensayos de alto rendimiento.

Por lo general, las personas nuevas en estos métodos de siembra pueden tener dificultades porque las manipulaciones requieren movimientos cuidadosos y coordinados, evitando el contacto con superficies no estériles. Aprender estos procedimientos rutinarios requiere capacitación y práctica. Quien demostrará los procedimientos será mi coordinador de laboratorio, el Dr. Kris Reddi.

- [Narrador] Comience a trabajar con microorganismos conociendo las normas de laboratorio y las precauciones de seguridad, incluyendo la clasificación de riesgo biológico, la descontaminación y la eliminación de residuos. Confirme que todos los instrumentos, soluciones y medios para los procedimientos de siembra sean estériles. Asimismo, establezca un área de trabajo limpia. Límpiela con desinfectante. Configure un mechero Bunsen con un tubo conectado a una línea de gas, organice los materiales necesarios etiquetados adecuadamente. Proceda a lavarse las manos cuidadosamente con jabón antiséptico y agua tibia. Primero, moje las manos con agua corriente tibia, luego aplique y distribuya abundantemente el jabón. Frote vigorosamente las manos generando fricción sobre todas las superficies, incluyendo los pulgares, el dorso de los dedos, el dorso de las manos y debajo de las uñas. A continuación, enjuáguelas completamente para eliminar el jabón residual y séquelas con toallas de papel dispensadas desde un portatoallas. Finalmente, con una toalla de papel nueva, cierre el grifo. El procedimiento de siembra por estrías está diseñado para aislar cultivos puros de bacterias, o colonias, a partir de poblaciones mixtas mediante una separación mecánica simple. Retire una placa de agar de una caja fría a cuatro grados Celsius y precáliele a temperatura ambiente. Seleccione una herramienta del conjunto de instrumentos para sembrar la placa. Asegúrese de que la placa esté seca y sin condensación en la tapa. Etiquete la base de la placa de agar alrededor del borde. Cuando tenga destreza, utilice una sola placa para múltiples muestras. Luego encienda el mechero Bunsen para flamear el asa metálica. Comience a tres o cuatro pulgadas del asa metálica, colocando el alambre en la punta del cono azul, la parte más caliente de la llama del mechero Bunsen. Cuando el metal se ponga al rojo vivo, mueva el alambre para que la llama alcance el asa. Para enfriar el asa, tóquela al borde del medio de agar, generando un sonido de chisporroteo. Continúe recogiendo el inóculo en el asa. Levante la mitad inferior de la placa. Mueva el asa de adelante hacia atrás desde el borde hasta el centro en el primer cuadrante de la placa. Coloque la placa invertida nuevamente sobre la tapa. Vuelva a flamear el asa metálica. Gire la placa Petri 90 grados. Toque el asa cerca del final de la última estría usando el patrón de ida y vuelta, cruce la mitad final de las estrías en el primer cuadrante y luego avance hacia el segundo cuadrante vacío. Una vez completado el segundo cuadrante, coloque la placa. Repita el procedimiento de siembra para el tercer y cuarto cuadrantes, evitando el contacto con el primer cuadrante. Para sembrar con un palillo estéril plano, sostenga el extremo estrecho suavemente entre el pulgar y el dedo anular a un ángulo de 10 a 20 grados respecto al medio, y use el extremo ancho para sembrar los cuadrantes. Invierta la placa sobre la tapa entre cuadrantes y deseche el palillo adecuadamente. Proceda a incubar las placas sembradas boca abajo. El procedimiento de siembra por vertido permite enumerar el número total de unidades formadoras de colonias en la superficie y dentro del agar de una sola placa. Configure un temporizador durante 10 minutos, luego transfiera 18 mililitros de medio de agar fundido desde un baño de agua a 55 grados Celsius hasta un bloque térmico a 48 grados Celsius y equilibre durante 10 minutos. Etiquete la base de una placa Petri estéril. Si aplica, incluya el factor de dilución. Ahora, dispense un mililitro de muestra en el centro de la placa Petri. Cierre la tapa. Retire la tapa del tubo de agar fundido y pase el borde del tubo abierto por la llama. Vierta cuidadosamente el agar en la placa Petri. Cierre la tapa y luego mezcle la muestra con el agar girando suavemente la placa. Espere 30 minutos para permitir que el agar se solidifique. Una vez que el agar se haya solidificado, invierta la placa y colóquela en un cuarto cálido. La siembra por extensión tiene como objetivo separar microorganismos contenidos en un pequeño volumen de muestra, distribuyendo las colonias resultantes uniformemente sobre la superficie del agar. Equilibre una placa a temperatura ambiente y etiquétela adecuadamente. Coloque la placa sobre la plataforma giratoria. Pipetee 0,1 mililitros de muestra en el centro del agar y cierre la tapa. Ejecte la punta en un recipiente de desecho. Sumerja la varilla metálica en un vaso de precipitados con etanol al 70 %, cubriendo toda la parte inferior del espátula y la primera pulgada del vástago, y luego escúrrala. Encienda el exceso de etanol pasándolo por la llama del mechero Bunsen. A continuación, abra la tapa de la placa de agar y enfríe el espátula tocándolo al agar en el borde, cerca del perímetro. Gire lentamente la plataforma. Sosteniendo suavemente el espátula sobre la superficie del agar, extienda gradualmente la muestra de forma uniforme sobre toda la placa usando un movimiento de ida y vuelta mientras la plataforma gira. Cierre la tapa y permita que la muestra se absorba completamente durante al menos cinco minutos. Luego, incube la placa invertida. Primero, etiquete adecuadamente la placa de agar. Abra la tapa de la placa de agar. Luego abra el recipiente de perlas de vidrio previamente esterilizadas y flamee el borde. Dispense cuidadosamente de 10 a 12 perlas de vidrio estériles sobre una placa de agar. Cierre la tapa de la placa y flamee el borde del recipiente de perlas de vidrio antes de colocar la tapa. Ahora, pipetee la muestra en el centro del agar. Con un movimiento horizontal, agite suavemente las perlas sobre la superficie del agar siete veces. Si se realiza correctamente, el procedimiento suena como si se estuvieran agitando maracas. Gire la placa 60 grados y agite horizontalmente nuevamente siete veces. Vuelva a girar la placa 60 grados y repita la agitación. Verifique que la muestra se haya absorbido. Luego, vierta las perlas contaminadas en un vaso colector marcado que contenga lejía al 10 %. Incube la placa invertida. El ensayo de placas se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar fagos bacterianos. Cultive la bacteria indicadora hasta la fase exponencial y guárdela en hielo. Luego, etiquete dos tubos microcentrífugos estériles como fago y control, y añada 50 microlitros de muestra de fago o tampón, respectivamente, a cada uno. A continuación, agite suavemente el cultivo bacteriano en el matraz, transfiera una alícuota de bacterias a un tubo estéril y vortex suavemente la bacteria indicadora; luego añada 500 microlitros de bacterias a cada tubo de absorción. Mezcle agitando suavemente los tubos con los dedos. Nunca vortex ni pipetee vigorosamente las muestras de fago. Incube la mezcla de bacterias y fago a la temperatura adecuada para la cepa indicadora durante 20 minutos. Mientras tanto, transfiera dos tubos de agar blando desde un baño de agua a 55 grados Celsius hasta un bloque calefactor a 48 grados Celsius. Equilibre durante 10 minutos. Etiquete dos placas de agar duro nutritivo sin condensación, previamente equilibradas a temperatura ambiente. Retire un tubo de agar blando del bloque térmico y verifique que el contenido no esté demasiado caliente al tacto. A continuación, transfiera asépticamente la mezcla desde el tubo de absorción de fago al tubo de agar blando. Luego, rote rápidamente entre las palmas para mezclar el contenido. Con el tubo en una mano, abra la tapa de la placa de agar duro con la otra. Inmediatamente vierta todo el contenido del tubo sobre la superficie de una placa de agar duro. Mueva suavemente la placa de un lado a otro. Cierre la tapa y coloque la placa sobre una superficie nivelada durante 30 minutos hasta que el agar blando se solidifique. A continuación, repita el procedimiento para el tubo de absorción de control, transfiriendo la mezcla de control a un tubo de agar blando. Mézclelo, viértalo sobre una placa de agar duro, muévalo suavemente y deje que el agar blando se solidifique durante 30 minutos. Inspeccione las placas en busca de formación de placas. Para aislar una placa a partir de una mezcla heterogénea, punce cuidadosamente el centro con un palillo estéril y transfiera el inóculo a un tubo microcentrífugo estéril que contenga 100 microlitros de tampón de fago. Continúe purificando este lisado repitiendo el ensayo de placas de tres a seis veces, con diluciones seriadas según sea necesario. El trasplante por replica explota un fenotipo seleccionable al permitir la comparación del crecimiento celular en una placa primaria con placas secundarias. Marque una cuadrícula en la base de la placa, etiquete la placa primaria y numere los cuadrados resultantes. Ahora, utilice una técnica aséptica para retirar un palillo previamente esterilizado del vaso, toque el centro de cada cuadrado con una muestra de células y deseche el palillo en un recipiente de desecho adecuado. Incube la placa primaria. Apile la placa primaria y todas las placas secundarias. Coloque una marca de orientación en el lateral de la mitad inferior de las placas. A continuación, retire un trozo de tela de terciopelo estéril de su envoltorio y colóquelo sobre el bloque cilíndrico. Luego, coloque el soporte alineando las marcas del soporte con las del bloque. Observe la marca de orientación en el bloque y el soporte. A continuación, retire la tapa de la placa primaria. Alinee las marcas de orientación de la placa y del bloque. Baje la placa para que la superficie del agar entre en contacto con la tela de terciopelo. Usando las yemas de los dedos, presione suavemente y uniformemente sobre la parte posterior de la placa primaria y luego levántela cuidadosamente del bloque. Confirme que la impresión de las células sea visible en el terciopelo. Vuelva a colocar la tapa en la placa. Ahora, repita secuencialmente el protocolo sobre la tela de terciopelo con cada una de las placas secundarias. Use la impresión de células del terciopelo de la placa primaria para inocular hasta ocho placas secundarias ordenadas desde el sustrato menos hasta el más favorable. Finalmente, como control positivo, para la última placa de la serie, use un medio de agar en el que todas las cepas probadas deberían crecer. Sujete las placas invertidas juntas con cinta adhesiva e incúbelas. Inspeccione las placas secundarias en busca de crecimiento. Apague el mechero Bunsen y guarde todos los materiales. Coloque la ropa de laboratorio contaminada, el material de vidrio y los residuos peligrosos en el recipiente de desecho adecuado. Limpie el área de trabajo con desinfectante. Finalmente, lávese las manos cuidadosamente con jabón antiséptico y agua tibia. Serratia Marcescens es una proteobacteria gramnegativa en forma de bastón que produce un pigmento rojizo llamado prodigiosina. Se encuentra comúnmente creciendo en baños y en cortinas de ducha. En este ejemplo, la técnica de siembra por estrías genera colonias individuales en el cuarto cuadrante. Este análisis de bacterias presentes en una muestra de agua recolectada de una fuente pública de agua potable utiliza la técnica de siembra por vertido. Observe la diferencia en la apariencia de las colonias. Las colonias superficiales son grandes y de forma circular, mientras que algunas colonias superficiales son muy pequeñas y de forma irregular. La técnica de siembra por extensión es un componente importante en experimentos de enriquecimiento, selección y cribado. Por ejemplo, el método copacabana es una herramienta diferenciadora en la prueba clásica azul-blanco en la tecnología del ADN recombinante. El fago T4 es un fago de ADN de doble cadena virulento que infecta a su huésped Escherichia coli, provocando la lisis y liberación de fagos progenie. Este ensayo de placas en agar EHA muestra fagos en zonas de claridad de aproximadamente un milímetro de diámetro. En ausencia de partículas de fago infecciosas, el crecimiento bacteriano resulta en una suspensión turbia de células en el agar blando, en la cual no son visibles colonias discretas. En la técnica de capa de agar blando, las morfologías de las placas varían. Por ejemplo, aquí la misma cepa de micobacteria produce morfologías de placas distintas en presencia de fagos destructores de micobacterias frente a fagos de micobacterias MSSS. El poder del trasplante por replica radica en el cribado simultáneo de un gran número de microorganismos. En este caso, se probaron cuatro cepas de Pseudomonas por duplicado para su crecimiento en tres fuentes de carbono diferentes: acetamida, lactosa y glicina. Aquí, la placa primaria es un medio YTA completo inoculado con las cuatro cepas según se indica. Las cepas muestran patrones de crecimiento variables en placas replica de medio mínimo MSA suplementado con una única fuente de carbono: acetamida, lactosa o glicina. Todas las cepas crecen en la última placa de control positivo, confirmando que las células se transfirieron a todas las placas secundarias en esta serie. La tabulación de estos resultados de placas replica detalla el cribado simultáneo de diferentes cepas silvestres para sus requerimientos característicos de crecimiento.

— Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar procedimientos de siembra sin contaminar los medios ni las culturas, así como de cómo utilizar el método de siembra adecuado para cualquier tarea experimental dada en el laboratorio. Adquirir destreza en estas técnicas requiere práctica. Sin embargo, con una formación adecuada, los procedimientos de siembra descritos en este video se volverán naturales al trabajar en la mesa de laboratorio.