Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

Hay relativamente pocos medicamentos disponibles para tratar Mycobacterium tuberculosis, por lo que la resistencia a cualquier fármaco es motivo de preocupación. Este artículo en video describe un procedimiento para probar la resistencia antibiótica de M. tuberculosis a 12 fármacos antimicrobianos diferentes simultáneamente. Por lo tanto, la capacidad de detectar rápidamente la resistencia antimicrobiana de M. tuberculosis es muy importante en los esfuerzos por controlar el aumento de cepas resistentes. Aquí se prueba la susceptibilidad a antibióticos.

M. tuberculosis se cultiva primero en medios sólidos o en caldo, obteniendo una suspensión bacteriana. Se prepara el inóculo y se añade a una placa de microtitulación que contiene diferentes concentraciones de 12 fármacos, incluyendo medicamentos de primera y segunda línea. Tras la incubación, el grado de crecimiento en cada pocillo se determina manualmente mediante una caja con espejo o utilizando un lector de placas semiautomatizado.

Los datos obtenidos indican la concentración inhibitoria mínima para cada fármaco evaluado y muestran a qué antibióticos es resistente la cepa de TB analizada. Estos resultados ayudan a elegir el fármaco adecuado para el tratamiento de la TB. Hola, mi nombre es Nancy Ek y soy directora del Laboratorio de Micobacteriología en la Clínica Mayo en Rochester, Minnesota.

Hoy vamos a describir un método para realizar pruebas de susceptibilidad a antibióticos para Mycobacterium tuberculosis. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la dilución en caldo macroscópica es que se determina una CIM para cada fármaco y se prueban simultáneamente 12 antibióticos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kurt Jude, especialista en control de calidad en mi laboratorio, trabajando en una mesa de laboratorio.

Prepárese para este procedimiento etiquetando una placa de agar sangre, tres placas Middlebrooks siete H 10, un tubo de bolas de vidrio con salina Tween y una placa de microtitulación con el nombre del paciente y el número de identificación de la muestra. Además, etiquete la placa de agar sangre y las placas siete H 10 como pureza. Marque una de estas placas siete H 10 como recuento de colonias uno a uno y la otra como recuento de colonias uno a 50.

Luego, coloque la bandeja en el pasamuros. A continuación, prepárese para trabajar en la instalación de nivel tres de bioseguridad BSL-3 poniéndose una bata de frente cerrado, cubierta para la cabeza, guantes, fundas para zapatos y un respirador. Aquí se utiliza un respirador PAPR.

Luego retire la bandeja del paso de transferencia. A continuación, en la instalación de nivel de seguridad biológica tres, desinfecte la superficie del gabinete de seguridad biológica. Luego coloque una toalla de papel empapada con desinfectante dentro de la campana, aproximadamente a seis pulgadas del panel del ventilador de aire, junto a la toalla de papel.

Coloque asas de inoculación, pipetas y puntas, un recipiente adecuado para eliminación de desechos, un nephi, TER y un vórtex. Una vez preparada la cabina, coloque el organismo sobre la toalla de papel junto con un portamatraces que contenga un patrón McFarland 0.5, caldo siete H nueve con OADC y un tubo de bolas de salina. Este montaje se realiza a partir de un medio sólido.

Prepare un inóculo a partir de un cultivo en medio sólido obtenido de una muestra del paciente. Utilice un asa estéril para raspar las colonias y transfiéralas al tubo de vidrio con perlas que contiene salino Tween. Vortexe la suspensión durante 30 a 60 segundos.

Inspeccione visualmente la muestra, comparándola con el estándar de McFarland. La cantidad transferida debe ser igual o mayor que la del estándar. Si no es así, agregue más de la muestra bacteriana y vortexe nuevamente.

Una vez que se haya igualado con el estándar de McFarland, deje reposar el inóculo durante 15 minutos para permitir que los agregados más grandes de bacterias sedimenten. A continuación, utilice un nefi TER para ajustar a cero la densidad de las bacterias en suspensión. El nephi ter.

Primero coloque un tubo en blanco con perlas de salina Tween en el Nephi ter. Presione el botón de calibración para cero el instrumento, luego coloque el estándar de McFarland 0.5 en el Nephi ter y presione el botón de calibración nuevamente. Una vez que el instrumento esté calibrado, retire el estándar de McFarland e inserte el inóculo.

La lectura del inóculo debe ser igual a la lectura del estándar de McFarland. Si la lectura es demasiado baja, retire el tubo y transfiera más bacterias desde la placa. Luego, vortexe y lea la muestra nuevamente.

Si la lectura es demasiado alta, agregue salina Tween al tubo y vortexee. Luego, lea la muestra nuevamente. Continúe ajustando el inóculo según sea necesario hasta que la concentración de las bacterias coincida con el estándar de McFarland.

A continuación, utilice un pipeteador de 200 microlitros y una punta de pipeta larga resistente a aerosoles para extraer 100 microlitros de inóculo del tercio superior del tubo. Para evitar cualquier grumo que se esté sedimentando en el fondo, inocule lentamente el caldo Middlebrook 7H9 y vortex la mezcla inoculada durante 20 segundos para sembrar el inóculo. Comience retirando la placa de microtitulación del envase del fabricante. Si el desecante es azul o si el envoltorio de aluminio está dañado, no lo utilice.

La placa ya contiene los 12 antimicrobianos que se probarán en cada pocillo, incluyendo los fármacos más efectivos o de primera línea y los de segunda línea. Vierta cuidadosamente el inóculo de caldo H nueve en un recipiente de vidrio, teniendo cuidado de no generar aerosoles. Luego, coloque la placa de microtitulación con la etiqueta hacia afuera, como se muestra aquí, y utilice un pipetador de 12 canales para añadir 100 microlitros del inóculo a cada pocillo.

A continuación, prepare placas para realizar recuentos de colonias. Primero, prepare una placa sin diluir transfiriendo un asa de un microlitro de muestra desde el pocillo del control positivo a la placa H 10 etiquetada como uno a uno. Luego, use el asa para rayar la placa como se muestra aquí.

A continuación, para preparar una dilución uno a 50, transfiera un asa de un microlitro desde el pocillo del control positivo y remuévala en el tubo con 50 microlitros de agua para estragar. Coloque un microlitro de esta dilución en la placa etiquetada como uno a 50. Inocule las placas de pureza pipeteando 50 microlitros del inóculo desde el trth hacia placas de agar sangre y placas 7 H 10 debidamente etiquetadas, y estrague para aislamiento.

Luego, coloque otro trth encima del trth inoculado y colóquelos suavemente en el recipiente de desecho. Coloque un sello adhesivo en la placa de microtitulación. A continuación, utilizando el respaldo blanco, presione firmemente cada pocillo para asegurar un sellado adecuado, asegurándose de que no haya arrugas.

Desinfecte la placa de microtitulación limpiándola con una toalla de papel empapada en un desinfectante bactericida para micobacterias. Luego, coloque la placa de microtitulación en una bolsa de plástico y ciérrela con sellado térmico. Finalmente, desinfecte todos los materiales, incluyendo el nefi, el vórtex, las placas y los tubos, limpiándolos con un desinfectante bactericida para micobacterias.

Aquí se utiliza el pro spray después de que haya transcurrido suficiente tiempo para garantizar la desinfección. 15 minutos para el pro spray. Las placas se sujetan con cinta adhesiva transparente, se colocan en bolsas de plástico y los suministros sellados se retiran de la cabina de seguridad biológica y se colocan en el pasamuros.

La bolsa roja de desecho se cierra y sella con una brida en este punto, luego se retira la bata, las fundas para zapatos y los guantes. Después de pasar a la sala de acceso y lavarse las manos, se retira el respirador, se desinfecta y se guarda tras volver a lavarse las manos; a continuación, se coloca una bata nueva y se abandona la suite de BSL-3. A continuación, el recipiente de desecho se autoclava.

A continuación, incubar la placa de microtitulación y las siete placas H 10 y de agar sangre en posición normal en el incubador a 35-37 °C con 5-10% de CO2 en el laboratorio de nivel de seguridad biológica dos. Esto es aceptable porque la placa está bien sellada y dentro de una bolsa de plástico. El tiempo de generación de Mycobacterium tuberculosis es aproximadamente de 12 a 24 horas, por lo que transcurrirá al menos una semana antes de que se observe crecimiento, en forma de un sedimento celular en el fondo del pozo control. En el día 10, realizar una lectura manual con espejo colocando la placa sellada de microtitulación AST sobre la plataforma de la caja de espejo.

Utilice una lámpara de escritorio para ayudar a visualizar el crecimiento y ajuste según sea necesario para obtener el mejor contraste. Verifique los pozos de control de crecimiento en este caso, H 11 y H 12, observando en el espejo. Si hay crecimiento, el pozo parecerá turbio o parecerá tener sedimento como se muestra aquí.

Si no hay crecimiento, como se muestra en este ejemplo, el pocillo parecerá estar claro. En este caso, coloque la placa nuevamente en el incubador y continúe la incubación hasta 21 días. Para cada condición, compare el crecimiento con el control.

Entonces, para cada registro de fármaco, la primera dilución que no presenta crecimiento. Esta es la concentración inhibitoria mínima o CIM del fármaco para examinar los resultados utilizando un lector automático de placas como el Vision. Comience abriendo el software Myco TB a ST plate y acceda al sistema. Coloque la placa sellada con el código de barras hacia afuera. Como se muestra aquí, el crecimiento aparece como turbidez o como un depósito de células en el fondo de un pocillo en la pantalla del ordenador.

Primero, examine los controles de crecimiento. Como antes. Si este es negativo para el crecimiento, coloque la placa nuevamente en el incubador durante hasta 21 días.

Si esto es positivo, registre los resultados tocando el primer pocillo que no muestre crecimiento en la pantalla para cada fármaco. En algunos casos, las bacterias, el sedimento o los fármacos precipitan en el fondo del pocillo. Este fenómeno, conocido como crecimiento residual, se indica mediante varios pocillos con el mismo tamaño de pellet y no se considera realmente un crecimiento positivo.

A continuación, se examinan las siete placas de H 10 y agar sangre para determinar las concentraciones bacterianas y evaluar la pureza. La placa de agar sangre no debe mostrar crecimiento tras 48 horas. El crecimiento en la placa de agar sangre indica contaminación con bacterias de rápido crecimiento.

Si hay crecimiento, debe repetirse la prueba en microplaca. La placa de pureza H 10 siete debe presentar crecimiento de un solo organismo. El tipo de tuberculosis EM debe verse de color amarillo pálido, arrugado, y rugoso. Si está contaminada, debe repetirse la prueba en microplaca a partir de un cultivo puro.

Para evaluar la concentración bacteriana, cuente las colonias en la placa H 10 siete. Luego, utilizando la tabla del documento escrito adjunto, calcule los conteos de colonias. Mycobacterium tuberculosis se cultivó a partir de una muestra de paciente y se evaluó la resistencia a antibióticos como se describe en este video; en la placa mostrada aquí, están presentes 12 fármacos diferentes en concentraciones crecientes, con las concentraciones más altas en la parte superior y las más bajas en la parte inferior.

La concentración inhibitoria mínima, o CIM del fármaco, se indicó mediante la concentración más baja del fármaco que no mostró crecimiento alguno y está marcada con un círculo en la imagen mostrada aquí, utilizando puntos de corte estandarizados establecidos por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio. Los datos mostrados aquí sugieren que esta cepa de TB será resistente a Isid y rifampicina. In vitro, las CIM elevadas observadas en varios otros fármacos, incluyendo oin, moxifloxacino, estreptomicina y rifabutina, sugieren la resistencia de la cepa de tuberculosis EM a estos agentes.

Los resultados de la CMI deben ser utilizados por un especialista en enfermedades infecciosas con experiencia en el tratamiento de la tuberculosis para elaborar un plan de tratamiento individualizado. Una vez dominada, esta técnica requiere aproximadamente 40 minutos para preparar un aislado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este es un patógeno respiratorio y que, una vez que se generan aerosoles, existe un riesgo significativo. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis mediante el método de dilución en caldo microbiano. No olvides que trabajar con Mycobacterium tuberculosis puede ser extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones, como la protección respiratoria, allí donde sean requeridas.