Mapeo de los circuitos neuronales inhibitorios por Laser Scanning fotoestimulación

El objetivo general de este procedimiento es investigar la organización funcional local de los circuitos neuronales inhibitorios. El procedimiento comienza con la preparación de cortes cerebrales vivos del córtex somatosensorial primario de ratones. El siguiente paso consiste en visualizar y registrar las actividades de tipos celulares inhibitorios que expresan GFP dirigido en el corte cerebral.

Tras esta estimulación fotónica mediante escaneo láser a través del glutamato, se utiliza la técnica de liberación fotoactiva para activar pequeños grupos de neuronas pre-sinápticas como excitadoras o inhibitorias. Se registran las corrientes post-sinápticas en las interneuronas que expresan GFP. El paso final consiste en realizar la estimulación fotónica, analizar los datos y generar mapas cuantitativos de la entrada sináptica hacia las neuronas registradas.

En última instancia, la combinación de la fotoestimulación mediante escaneo láser con grabaciones de células completas permite la elaboración de mapas detallados de las entradas sinápticas hacia tipos específicos de neuronas inhibitorias, lo que podría permitir determinar la organización y función de los circuitos corticales inhibitorios locales. La técnica basada en fotoestimulación fue pionera del Dr. Larry Katz, Ned Calloway, y posteriormente desarrollada por la Dra. Carols Waboda, mi directora de investigación, el Dr. Xing Z se capacitó con el Dr. Calloway, en el Instituto Salk, donde dirigió numerosos estudios que investigaban la circuitería interoral. Actualmente, nuestro grupo está ampliando y continuando estos estudios, investigando los circuitos interorales.

Para comenzar este procedimiento, sacrifique un ratón transgénico a las dos o tres semanas posnatales mediante decapitación y extraiga rápidamente el cerebro; coloque el cerebro en una solución de corte fría y oxigenada. Luego, utilice las gafas GFP para examinar visualmente el cerebro y verificar la expresión de GFP. A continuación, corte la corteza somatosensorial primaria en secciones de 400 micrómetros de grosor con un vibrátomo.

Incube las secciones en A CSF que contiene sacarosa, burbujeado con 95 %O₂ y 5 %CO₂, a 32 grados Celsius durante 30 minutos hasta una hora. Después de eso, transfiera las secciones al A CSF normal a temperatura ambiente para preparar el láser para el experimento; encienda el sistema de enfriamiento del láser y la fuente de alimentación. Luego, encienda todo el hardware relacionado con el control de la fotoestimulación, incluido el sistema de espejo de barrido, el modulador óptico y el obturador electrónico, así como un amplificador de entrada para fotodiodo.

A continuación, encienda los equipos electrofisiológicos, como el amplificador Multi Clamp 700 B y los micromanipuladores. Las grabaciones electrofisiológicas, la fotoestimulación y la obtención de imágenes se realizan en la cámara de perfusión de cortes montada sobre la platina motorizada del microscopio. Después, encienda la cámara de obtención de imágenes; el corte será visualizado en el microscopio invertido con óptica infrarroja DIC y epifluorescencia mediante el sistema de imagen.

Luego, abra el software FS basado en MATLAB y el software de la cámara Q Capture en el monitor. Antes de ejecutar el experimento, verifique el sistema de estimulación con luz láser y asegúrese de que se encuentre en estado de funcionamiento. Coloque un trozo de papel debajo del objetivo del microscopio 4x para observar el patrón de escaneo del láser mientras el sistema está en funcionamiento.

Para fabricar el microelectrodo con una resistencia de cuatro a seis megaohmios, tire de un electrodo de vidrio mediante el micropipeteador. A continuación, llene el electrodo con una solución interna que contenga biotina al 0,1 % para la etiquetación celular y la identificación morfológica. Luego, encienda el sistema de perfusión a presión para bombear LCR al interior de la cámara.

Asegúrese de mantener un nivel constante de fluido de 2.0 milímetros por encima del corte en la cámara. Se añade una alícuota de la solución stock de glutamato encagecinado MNI a 25 mililitros de ACSF circulante para obtener una concentración de 0.2 milimolar de glutamato encagecinado. Luego, transfiera un corte cerebral a la cámara de registro.

Active el sistema de obtención de imágenes para verificar la calidad del corte y localizar anatómicamente el área somatosensorial primaria. A continuación, fije el corte con un anillo de platino con hilo hecho a medida, teniendo cuidado de no colocar el fijador sobre la región cerebral destinada a la grabación. Visualice las células con un objetivo de 60 x basándose en la visualización de la expresión de GFP bajo un microscopio fluorescente DIC.

Identifique y seleccione los tipos de células inhibitorias. Tenga en cuenta que el registro se realizará bajo control visual con ayuda de DIC infrarrojo. Es necesario monitorear mediante video e intercambiar entre los modos DIC y fluorescente para confirmar la ubicación de la célula GFP mientras se baja el electrodo hacia la célula objetivo.

Utilizando la técnica convencional de registro de parche. Primero, aplique presión positiva al electrodo. Muévalo cerca de la superficie celular para establecer un abombamiento discernible en la membrana de la célula objetivo.

Luego, aplique presión negativa rápidamente para formar un sello giga y penetrar la célula mientras monitorea las respuestas a la inyección de corriente en el monitor de video. Tras la ruptura, obtenga imágenes del interneurona que expresa GFP registrado a 60 x de magnificación en modos DIC y fluorescente para la verificación en línea. Antes de recopilar los datos de estimulación fotónica, inyecte pulsos de corriente hiperpolarizantes y despolarizantes para examinar las propiedades electrofisiológicas básicas de cada célula.

Una vez que se logra un registro estable de célula completa con una buena resistencia de acceso, que generalmente es inferior a 20 megaohmios, cambie el objetivo del microscopio de 60x a 4x para la fotoestimulación con escaneo láser, adquiera una imagen del corte a 4x y utilícela para guiar y registrar los sitios de fotoestimulación. Establezca los parámetros de fotoestimulación y adquisición de datos activando el módulo de conmutación de configuración de phys. Utilice un pulso láser de un milisegundo de aproximadamente 20 milivatios con un intervalo de estímulo de un segundo.

Para la cartografía mediante estimulación fotónica, adquiera trazas de datos de un segundo muestreadas a 10 kilohercios. A continuación, cargue la imagen del corte en x en el módulo de mapeo de phys. Defina la ubicación del soma y configure los sitios de estimulación fotónica en un patrón de 16 por 16 con 80 micrómetros por 80 micrómetros.

Separación alrededor de la ubicación celular, que abarca todas las capas corticales. Luego, mapee el perfil de excitación de la neurona registrada mediante el examen de las ubicaciones de descarga en respuesta a la estimulación fotónica en el modo de fijación de corriente. Nuestro software fácil de usar, con funciones de visualización en línea, facilita los experimentos de mapeo.

A continuación, mapee las conexiones del circuito excitador local detectando las corrientes postsinápticas excitadoras desde la célula registrada. Con un escaneo láser en diferentes ubicaciones, mantenga la célula a menos 70 milivoltios en modo de fijación de voltaje para detectar corrientes excitadoras entrantes. Luego repita los mapas de corrientes postsinápticas excitadoras dos o tres veces, rotando o invirtiendo el patrón de estimulación fotónica. Para mapear las conexiones del circuito inhibitorio local, detecte las corrientes postsinápticas inhibitorias desde la célula registrada.

Mantenga la célula cerca de cero milivoltios en este caso, menos 15 milivoltios en modo de bloqueo de voltaje, con el fin de detectar corrientes inhibitorias salientes. Después de completar todos los ensayos fisiológicos, retire suavemente el electrodo de la célula registrada. Retire la sección de cerebro de la cámara, luego fíjela en paraformaldehído al 4 % durante la noche e tiña las células registradas contra biotina.

En este experimento, se utiliza la combinación de expresión de GFP, electrofisiología intrínseca y características morfológicas para clasificar las neuronas inhibitorias. Se muestra aquí un ejemplo y un mapa de datos brutos para ilustrar la fotoestimulación con escaneo láser, que permite un mapeo extenso de las conexiones del circuito cortical local hacia la neurona inhibitoria registrada. A continuación se presentan ejemplos de mapas cuantitativos codificados por colores derivados de los trazos brutos mostrados anteriormente en la Figura D. Las amplitudes de los eventos sinápticos detectados en la interneurona registrada se codifican por colores y se superponen topográficamente sobre las ubicaciones de fotoestimulación.

La ubicación del cuerpo celular se indica mediante el círculo rojo abierto en la barra de escala. Los colores cálidos indican entradas sinápticas fuertes y los colores fríos indican conectividad débil o nula con la célula objetivo. De manera similar, la figura E presenta el número de eventos sinápticos por ubicación de desencapsulación muestreada en la neurona registrada.

La figura F muestra el tiempo de inicio del primer evento sináptico detectado en la célula grabada tras la fotoestimulación, en la escala de la barra. Los colores cálidos indican una entrada con corta latencia, y los colores más fríos indican latencias sinápticas más largas. Por lo tanto, la LSPS permite la elaboración de mapas detallados de la posición, intensidad, latencia y número de entradas que llegan a tipos específicos de neuronas inhibitorias.

Bueno, al realizar este procedimiento, es importante ser paciente, mantener condiciones experimentales limpias y manipular las neuronas de manera eficaz y muy cuidadosa al cambiar del objetivo de alta magnificación a uno de baja magnificación. Luego, utilice adecuadamente el software de análisis.