Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica
13 de noviembre de 2011
El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.
El objetivo general de este procedimiento es recolectar ARN total de núcleos cerebrales discretos de manera repetible, consistente, rentable y libre de ARNasas. Esto se logra primero preparando un ambiente de trabajo libre de ARNasas y extrayendo el cerebro completo de un ratón decapitado. A continuación, se utiliza un cortador de tejidos operado con micrómetro para cortar secciones de tejido seriadas de tamaño uniforme.
Luego, las regiones cerebrales de interés se microdiseccionan utilizando un cilindro de tejido de diámetro definido, manteniendo el tejido en un medio libre de ARN. Finalmente, se aísla el ARN total de los núcleos cerebrales extirpados. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un rendimiento y calidad suficientes de ARN total para la preparación de bibliotecas de ADNc y el perfilado del transcriptoma mediante ensayos espectrofotométricos o fluorométricos.
La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la disección de regiones cerebrales asistida por microscopía de captura láser o la anatomía macroscópica es que se pueden obtener múltiples regiones cerebrales discretas de interés a partir del cerebro individual de un ratón de manera repetible y con un costo suficientemente bajo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como si los perfiles diferenciales de expresión de transcritos dentro de regiones cerebrales asociadas con circuitos neuronales específicos pueden correlacionarse con ciertos rasgos conductuales, respuestas ambientales y/o estados patológicos. Para prepararse para la microdisección, suplemente 100 mililitros de solución salina equilibrada de Earle o EBSS con 0,44 gramos de bicarbonato de sodio y 0,884 gramos de glucosa.
Trate el EBSS con 0,1 mililitros de DEPC en un frasco o botella autoclavable con tapón de rosca durante al menos 12 horas. A 37 grados Celsius. Coloque pipetas de vidrio de cinco y tres cuartos de pulgada en un vaso de precipitados de vidrio de un litro y coloque pinceles de artista con las cerdas orientadas hacia arriba en un cilindro graduado de vidrio de 100 mililitros.
Añada suficiente solución de agua tratada con DEPC para cubrir las pipetas y los cepillos. Cubra el vaso de precipitados y el cilindro graduado con papel de aluminio e incube durante al menos 12 horas a 37 grados Celsius. Después de la incubación de 12 horas con DEPC, caliente todos los materiales tratados con DEPC a una temperatura superior a 100 grados Celsius durante al menos 15 minutos. Enfríe. El EBSS a temperatura ambiente antes del almacenamiento a cuatro grados Celsius.
Vierta el H2O DD fuera del vaso de precipitados y del cilindro graduado y continúe incubándolos a más de 100 grados Celsius hasta que los materiales estén secos. Retírelos del incubador, enfríe a temperatura ambiente y guárdelos para uso posterior. El día del experimento, trate todas las superficies de trabajo para eliminar la contaminación con ARN y coloque el EBSS en un baño de agua ajustado a 40 grados Celsius para tamponar y oxigenar.
Infiltra el EBSS con 5 % de CO2 y 95 % de oxígeno colocando un tubo de gas en una pipeta de pastoreo libre de ARN e insertando la pipeta en el EBSS, cubriendo la abertura del recipiente de EBSS. Prepara un cortador de tejidos para la sección seriada del tejido cerebral.
Trate las superficies superior e inferior del cortador de tejidos. Para eliminar la contaminación por ARN, sujete un trozo rectangular de papel filtro Watman número cuatro a la superficie de plexiglás del cortador de tejidos. Sujete una cuchilla de doble filo al brazo del cortador.
Coloque el micrómetro en cero y ajuste la altura mínima del brazo cortador para permitir que la cuchilla de afeitar corte el papel filtro, pero no la placa de plexiglás. Reúna todos los materiales adicionales necesarios para la microdisección, incluyendo placas de cultivo celular de 60 por 15 milímetros libres de RNAsa, puntas de micropipeta curvas de 200 microlitros libres de RNAsa, tijeras curvas, hielo seco y tubos para la recolección de tejido. Coloque los tubos sobre hielo seco tras decapitar un ratón utilizando una guillotina para roedores y extraer el cerebro completo con el cerebro posterior y los nervios ópticos intactos.
Coloque el cerebro en la parte superior de una placa de cultivo celular libre de RNAsas de 60 por 15 milímetros. Luego transfiéralo a la superficie de trabajo para muestreo de tejidos. Utilice una pipeta libre de RNAsas para humedecer moderadamente el papel filtro adherido al cortador de tejidos con EBSS.
Humedezca el tejido cerebral con EBSS. Transfiera el cerebro al cortador de tejidos y colóquelo con la superficie ventral apoyada sobre el papel filtro. La línea media debe quedar perpendicular a la cuchilla del cortador y el borde rostral del cerebro debe estar en contacto con la cuchilla.
Utilice un pincel de artista tratado con A-D-E-P-C para mantener el cerebro inmóvil aplicando una presión suave sobre la superficie dorsal del cerebro mientras lo sostiene fijo. Eleve la palanca del porta hoja aproximadamente cuatro a cinco centímetros por encima de la superficie del tejido dorsal y manténgala en esta posición. Retire el pincel de la superficie del cerebro y marque 750 micrómetros.
Uso del micrómetro. Permita que la palanca caiga, cortando el tejido y creando una sección coronal de 750 micrómetros mientras la cuchilla del cortador permanece estacionaria. Utilice un movimiento de rodamiento con el pincel de artista para deslizar suavemente la sección de tejido lejos de la superficie de la cuchilla.
Coloque inmediatamente la sección del tejido en el EBSS oxigenado dentro de la placa de Petri. Esta sección ya está lista para la microdisección. Repita el procedimiento de corte hasta obtener secciones cerebrales seriadas a lo largo de todo el plano rostrocaudal para llevar a cabo la microdisección.
Primero, verifique la iluminación para asegurarse de que la iluminación de la muestra no esté obstruida. Ajuste la posición y el flujo de la mezcla de O2 y CO2 para mantener un entorno oxigenado tamponado para el tejido. Durante el procedimiento, identifique la sección coronal del cerebro que incluye la región de interés y, utilizando un pincel de artista, colóquela plana en el fondo de la placa de Petri.
Seleccione el núcleo de tejido con el diámetro adecuado. Sujete la sección de tejido coronal en su lugar con el pincel de artista y acerque la punta cortante del núcleo de tejido sobre la superficie de la sección de tejido. Mientras aplica presión, presione la punta del núcleo de tejido a través de la sección de tejido y hacia abajo firmemente sobre el fondo de la placa de Petri.
Utilice un movimiento circular rotatorio para asegurar que la región de interés se haya disociado del tejido circundante. Levante cuidadosamente el núcleo del tejido desde la sección de tejido y libere el microcorte, permitiéndole flotar en el EBSS usando un pincel de artista. Deposite inmediatamente el microcorte de tejido en un tubo de almacenamiento estable a menos 80 grados Celsius mantenido sobre hielo seco.
El tejido debe adherirse fácilmente al costado del tubo. Devuelva el tubo que contiene la muestra de microdisección al hielo seco. Repita esta microdisección para cada región cerebral de interés.
Una vez finalizada la microdisección, registre la etiqueta o los códigos de barras correspondientes para cada tubo que contenga muestras. Coloque las muestras de tejido en un congelador a menos 80 grados Celsius hasta la extracción de ARN para extraer el ARN de las muestras de tejido. Primero, prepare un área de trabajo libre de ARN.
Prepare una cantidad suficiente de mezcla de perlas magnéticas y solución de lisis y unión según se describe en el manual del kit de aislamiento de ARN total. Saque las muestras de tejido del congelador a menos 80 grados Celsius y coloque los tubos directamente sobre hielo seco. Añada 100 microlitros de la solución de lisis y unión a un tubo de muestra.
Sujete un pistilo del tamaño de un tubo de 0,5 mililitros libre de nucleasas al mezclador de pellet e homogenice el tejido utilizando una punta de pipeta libre de nucleasas con baja retención. Transfiera inmediatamente la muestra homogeneizada a un pocillo de una placa de cultivo celular redonda de 96 pocillos utilizando el mismo tipo de punta. Añada 60 microlitros de isopropanol al 100% a la muestra.
Agregue 20 microlitros de la mezcla de perlas a la muestra y mezcle pipeteando de arriba abajo tres a cuatro veces. Siga los pasos del protocolo del kit de aislamiento de ARN total para completar la extracción de ARN total. Finalmente, mida la pureza y la concentración del ARN total resultante. Los datos procedentes de microfragmentos de diversas regiones cerebrales se muestran en esta tabla.
Las muestras de ARN suspendidas con 30 microlitros de tampón de elución proporcionaron suficiente ARN total para su uso con productos comerciales disponibles para la preparación de ADNc destinados a aplicaciones de secuenciación de ARN. Además, el rendimiento de ARN y las relaciones de 260 a 280 son valores únicos obtenidos de muestras respectivas de microdisección para demostrar las lecturas obtenidas de cada región cerebral, y confirman la alta pureza de las muestras. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en ocho a diez minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar el riesgo de contaminación de ARN en superficies de trabajo o en muestras de tejido utilizando únicamente materiales libres de ARN o tratados con Dnasa.
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Descripción general
Este artículo describe un protocolo para el perfilado de expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón, haciendo hincapié en una estrategia precisa y repetible de recolección de tejido. El método combina la sección coronal del cerebro con microdisección asistida por punzón de tejido para obtener ARN total de alta calidad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología molecular
- Perfilado de ARN
Antecedentes
- El perfilado de la expresión de ARN es fundamental para comprender la función cerebral.
- Los núcleos cerebrales discretos requieren una disección cuidadosa para un análisis preciso.
- Mantener un entorno libre de ARNasas es esencial para la integridad del ARN.
- Los métodos anteriores carecían de consistencia y repetibilidad.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo confiable para la extracción de ARN de regiones cerebrales de ratón.
- Asegurar un alto rendimiento y calidad del ARN para aplicaciones posteriores.
- Facilitar el perfilado del transcriptoma mediante métodos mejorados de recolección de tejido.
Métodos Utilizados
- Preparación de un entorno de trabajo libre de RNasas.
- Descabezamiento y extracción del cerebro completo del ratón.
- Seccionado uniforme del tejido cerebral utilizando un cortador de tejidos operado por micrómetro.
- Microdisección de regiones cerebrales diana utilizando un núcleo de tejido en un medio libre de ARN.
Resultados principales
- Se obtuvo un alto rendimiento de ARN total a partir de los núcleos cerebrales diseccionados.
- Se confirmó que la calidad del ARN era adecuada para la preparación de bibliotecas de ADNc.
- Los resultados respaldan la utilidad del método para el perfilado del transcriptoma.
- Los ensayos demostraron una calidad suficiente del ARN para aplicaciones posteriores.
Conclusiones
- El protocolo descrito proporciona un enfoque confiable para la extracción de ARN.
- Mejora la consistencia y calidad de las muestras de ARN de regiones cerebrales de ratón.
- Este método es beneficioso para futuras investigaciones en neurociencia que impliquen análisis de ARN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este enfoque de microdisección permite el aislamiento reproducible y de alto rendimiento de ARN total a partir de regiones cerebrales murinas discretas, abordando un cuello de botella clave en la validación de dianas en neurociencia, donde los bajos rendimientos de ARN provenientes de la microscopía por captura láser dificultan el perfilado del transcriptoma. Al proporcionar una calidad de ARN constante, adecuada para la secuenciación de nueva generación, el método apoya la reducción mecanicista de riesgos en dianas del sistema nervioso central y mejora la confianza predictiva en los flujos de trabajo iniciales de descubrimiento. Se posiciona como una alternativa escalable y rentable para estudios de expresión génica específicos de regiones cerebrales en la evaluación preclínica de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de ARN de núcleos cerebrales específicos para correlacionar la expresión transcripcional con la función del circuito neuronal y los fenotipos conductuales.
- Valor operativo: Proporciona una recolección de muestras repetible y rentable a partir de múltiples regiones discretas por ratón, reduciendo el uso de animales y aumentando el rendimiento para la desactivación de riesgos de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Proporciona ARN total con rendimiento y pureza suficientes para ensayos posteriores de RNA-Seq y qRT-PCR, lo que permite el desarrollo confiable de ensayos para cribado de expresión génica en modelos de tejido cerebral.
- Valor operativo: Utiliza el aislamiento de ARN mediante perlas magnéticas compatible con flujos de trabajo de alto rendimiento, facilitando la estandarización en campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita el perfilado transcriptómico relacionado con enfermedades en modelos de ratón, alineándose con los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores traslacionales en trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos.
- Valor operativo: Asegura la integridad del ARN mediante protocolos libres de RNasas, mejorando la reproducibilidad en estudios preclínicos longitudinales y la comparabilidad de datos entre laboratorios.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos prometedores, donde el perfilado preciso del ARN en regiones cerebrales informa la selección y priorización de dianas antes de la validación preclínica.
- Biología del descubrimiento: Facilita la aclaración de rutas metabólicas y la reducción de riesgos biológicos mediante la comparación transcriptómica entre regiones cerebrales discretas asociadas a circuitos neuronales específicos.
- Detección: Genera entradas estandarizadas de ARN adecuadas para cribados cuantitativos de expresión génica, mejorando la reproducibilidad en ensayos de interacción con dianas.
- Análisis: Produce ARN de alta calidad para cuantificación espectrofotométrica y fluorométrica, permitiendo una normalización precisa de la cantidad de entrada en aplicaciones basadas en secuenciación y PCR.
- Investigación traslacional: Conecta los perfiles de expresión en fase de descubrimiento con la continuidad preclínica al proporcionar datos transcriptómicos relevantes para la enfermedad procedentes de regiones cerebrales definidas.
- Reutilización institucional: Establece una plataforma reutilizable de colección de tejidos y aislamiento de ARN aplicable a múltiples proyectos de neurociencia y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante datos precisos de expresión específicos de región cerebral.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante procedimientos libres de RNasas y un tiempo mínimo de manipulación (8–10 minutos por muestra).
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir múltiples muestras regionales de un solo animal, reduciendo los costos asociados con métodos de bajo rendimiento que requieren amplificación.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización de objetivos ajustada al riesgo al proporcionar datos confiables del transcriptoma para decisiones de avance o interrupción en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neuroanatomía y técnica libre de RNasas para mantener la integridad de la muestra durante la disección y la extracción de ARN.
- Depende del acceso a un cortador de tejidos operado por micrómetro, perforadores de tejido de diámetro fijo y kits de aislamiento de ARN basados en perlas magnéticas.
- Necesita protocolos estandarizados de entornos libres de RNasas entre los equipos para garantizar la consistencia entre estudios en la calidad del ARN.
- La adaptación a otras regiones cerebrales o especies podría requerir la optimización del diámetro del núcleo de tejido y de los parámetros de seccionamiento.
- Límite práctico: el punzonado manual de tejido puede limitar aplicaciones de ultraalto rendimiento en comparación con sistemas automatizados de captura láser, aunque ofrece un mayor rendimiento de ARN.
