Aislamiento y Caracterización de Hoechst ^Baja CD45 ^Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Este video demuestra un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimatosas pulmonares negativas con bajo nivel de CD45. Las células madre mesenquimatosas, o MSCs, son reguladores importantes de la reparación o regeneración tisular, la fibrosis, la inflamación y la angiogénesis. Primero, se diseccionan los pulmones de un ratón sacrificado.

El tejido pulmonar se digiere para obtener una suspensión de células individuales. Las células se tiñen con el colorante hoax y CD45 y se clasifican mediante citometría de flujo para obtener MSCs pulmonares CD45 negativas de bajo contenido en células hospedadoras. Luego, los MSCs pulmonares se amplifican en cultivo y se realiza un ensayo de formación de colonias para evaluar las capacidades de diferenciación de los MSCs.

Posteriormente, se pueden realizar estudios adicionales para examinar el papel de las MSC en la homeostasis tisular y en la enfermedad. El método que mostramos aquí puede utilizarse para aislar células madre mesenquimales pulmonares de ratón o humanas, y puede aplicarse a este estudio de enfermedades pulmonares como la fibrosis pulmonar, la hipertensión pulmonar y la EPOC. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la variedad de métodos disponibles para la preparación de tejidos, así como para el ajuste del citómetro de flujo, los controles apropiados y el análisis.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que es difícil describir únicamente con palabras la técnica adecuada para picar y digerir el tejido pulmonar con el fin de obtener una viabilidad óptima de las células. Asimismo, el montaje del instrumento de citometría de flujo y los análisis se comunican mejor mediante una demostración. Comience este protocolo extrayendo los pulmones que se utilizarán para obtener células madre mesenquimales de un ratón adulto sacrificado.

Utilice un par pequeño de tijeras afiladas para cortar lateralmente la caja torácica en cada lado del ratón. Abra la cavidad torácica y luego retire el diafragma. Introduzca una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20 y medio en el ventrículo derecho del corazón y presione suavemente el émbolo para perfundir con tres a cinco mililitros de PBS, eliminando la sangre de los pulmones.

A continuación, usando tijeras, corte la tráquea y los grandes bronquios y deséchelos. Luego, con pinzas, tome los pequeños lóbulos pulmonares blancos y colóquelos en una placa de Petri llena con solución salina tamponada de Hank o HBSS.

Luego retire el corazón y separe los lóbulos pulmonares. Repita este procedimiento con todos los ratones del estudio. Transfiera los lóbulos pulmonares a la tapa del recipiente.

Humedezca el tejido con suficiente HBSS para evitar que se seque. Luego, utilizando un escalpelo desechable, pique los lóbulos pulmonares para obtener médula ósea que servirá como control de sostenimiento para citometría de flujo. Utilice un par de tijeras afiladas para cortar en el tobillo y en la parte superior del fémur.

Coloque el miembro en una nueva placa de Petri. Luego corte la rodilla, dejando una pieza lineal del fémur y una segunda pieza que contiene la tibia y el peroné. Usando pinzas, retire el músculo para exponer la tibia, el peroné y el fémur.

Ahora tome una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 26 y media e inserte la aguja en la abertura de la médula ósea. En un extremo de la tibia, sostenga el hueso con el otro extremo dirigido hacia un tubo cónico de 50 mililitros lleno con 15 mililitros de HBSS y presione el émbolo para dispensar HBSS y lavar la médula ósea hacia el tubo. Repita este proceso con la fíbula y el fémur.

Tiña la médula ósea con el huésped 3 3 3 4 2 a una concentración final de cinco microgramos por mililitro en DMEM de glucosa alta suplementado. A continuación, se generará una suspensión de células individuales del tejido pulmonar a partir del tejido aislado. Coloque cada pulmón en un tubo que contenga precalentado 0,2 % Worthington.

Colagenasa tipo dos preparada en HBSS estéril, luego sumerja el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius e incube durante 30 minutos. Tras la incubación, utilice la pipeta de 10 mililitros para triturar la muestra hasta que el digesto fluya fácilmente a través de la pipeta. Repita aproximadamente 10 veces e incube adicionalmente 15 minutos a 37 grados Celsius para completar la digestión del tejido.

Una vez finalizada la digestión, diluya la suspensión celular con HBSS y utilice una pipeta de cinco mililitros para volver a tritar cualquier fragmento residual de tejido. A continuación, para eliminar los fragmentos de tejido no digeridos, vierta la suspensión a través de un filtro celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Añada la suspensión poco a poco para permitir que la muestra fluya a través del filtro celular.

Si los fragmentos de tejido no digeridos bloquean completamente el flujo de la suspensión celular, vierta a través de un nuevo filtro celular hacia un tubo nuevo. Precipite la suspensión celular durante 10 minutos a 450 RCF.

Tras la centrifugación, decante el sobrenadante y resuspenda suavemente el botón celular en tampón para la lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente. Incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada un volumen igual de HBSS para inactivar el tampón de lisis.

Vierta la suspensión celular en un filtro celular de 40 micrómetros para eliminar los restos y los agregados celulares, recolectando el flujo filtrado en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilizando un hemocitómetro, determine el número de células en las muestras de pulmón y médula ósea. Registre la concentración y el volumen total de la suspensión celular.

Luego, pelletice la suspensión de células individuales de pulmón mediante centrifugación a 450 RCF durante 10 minutos. Para mantener las células, resuspenda simultáneamente las células de pulmón y de médula ósea. Diez elevado a seis células por mililitro en DMEM con alto contenido de glucosa suplementado y precalentado.

Para teñir el ADN, agregue el colorante HOAXED 3 3 3 4 2 hasta una concentración final de cinco microgramos por litro. A continuación, mezcle las células mediante inversión suave e incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante exactamente 90 minutos. Luego, centrifugue durante 10 minutos a 450 Gs a cuatro grados Celsius después de la centrifugación.

Continúe con la tinción del tejido pulmonar y de médula ósea con anti CD45 y yoduro de propidio en preparación para el análisis mediante citometría de flujo. Una vez que las células hayan sido marcadas, almacene los tubos en hielo protegidos de la luz hasta que se realice el análisis por citometría de flujo. Prepárese para la citometría de flujo asegurándose de que los láseres del instrumento estén alineados y configurados para el ordenamiento celular.

El instrumento utilizado debe estar equipado con láseres azul de 488 nanómetros, rojo de 635 nanómetros y UV de 350 a 355 nanómetros, con dos detectores en la trayectoria del láser UV con filtros azul 45/65 y rojo 675/50. Además, el detector UV rojo debe tener alta sensibilidad para la señal roja y el instrumento debe contar con una unidad refrigeradora para mantener la muestra a 10 grados Celsius. En el software del instrumento, configure gráficos de histograma para mostrar dispersión directa lineal frente a dispersión lateral, y un gráfico de discriminación de dobletes adecuado para el instrumento.

Un gráfico de histograma de PI utilizando una señal logarítmica, un gráfico de dispersión rojo versus azul usando señales lineales y un gráfico de histograma de CD45 APC utilizando una señal logarítmica. Una vez que el instrumento esté listo, coloque la muestra de médula ósea teñida en el puerto de carga del instrumento. Esta muestra se utiliza como control de tinción y de configuración del instrumento.

Comience a recopilar eventos y ajuste las señales lineales de dispersión directa. Para visualizar claramente la población celular, las células deben ubicarse aproximadamente en la parte inferior central del gráfico, con la dispersión directa en el eje x. Dado que el colorante nuclear PI es permeable a membranas IMP, será excluido de las células vivas.

Dibuje una región de selección en la población de células muertas positivas para PI en el histograma de PI. Instruya al software del instrumento para colorear las células muertas con este color de compuerta: rojo.

Es útil utilizar el color de las células muertas con ventilación como guía para identificar la población huésped G0/G1. La tinción con PI también es excitada por el láser UV y la mayoría de las células muertas deben estar fuera de escala. En el lado derecho del gráfico de fluorescencia roja versus azul hoaxed, la población G0/G1 de la médula ósea debe observarse como un grupo compacto de eventos en el gráfico de fluorescencia roja versus azul hoaxed.

Ajuste los voltajes del detector para colocar el grupo G0G1 en la parte superior derecha del centro del gráfico. Una porción de la fase S y todo el G2 del ciclo celular pueden estar fuera de escala. En la parte superior derecha del gráfico de rojo versus azul manipulado, se observará que la población lateral de bajo nivel se extiende desde el lado izquierdo del grupo G0G1 hasta la esquina inferior izquierda del gráfico.

Ahora dibuje una compuerta alrededor del grupo celular en el gráfico de FSC versus SSC. Represente la población de células individuales identificada en el gráfico de dobletes y las células viables en el histograma de PI. Luego asigne el gráfico hoax para mostrar únicamente estas poblaciones compuertadas.

Después de seleccionar el gráfico del hospedador, dibuje una región alrededor de la población lateral. Asigne esta región como un filtro al histograma de CD45 APC junto con los filtros de dispersión lateral de partículas simples y de células viables. Ahora que el sistema está configurado, retire la muestra del puerto de carga y coloque la muestra de pulmón en el puerto de carga.

Los ajustes del instrumento no deberían necesitar ser modificados nuevamente para esta muestra. Comience a recolectar eventos en el gráfico de rojo versus azul. El grupo G cero G uno para la muestra pulmonar generalmente aparece más alargado en la dirección del eje x y se asemeja al símbolo de tilde en un teclado.

La puerta de población lateral debe estar en una posición similar a la establecida para la muestra de médula ósea. Pueden ser necesarios pequeños ajustes hacia arriba o hacia abajo para garantizar una resolución nítida de la población lateral. Mantenga una baja diferencia de presión durante la clasificación, asegurándose de que la válvula de flujo de la muestra no esté abierta en exceso.

A continuación, para aislar las CMM, coloque una placa de recolección de 96 pocillos en la cámara de clasificación y configure las compuertas de clasificación en el histograma de CD45-A PC para separar las poblaciones positiva y negativa. Finalmente, recolecte las células ya sea como una población mixta en un tubo o células individuales para aislar clones en una placa de 96 pocillos. Tras la recolección de las CMM pulmonares mediante clasificación celular, las células se siembran en placas de 30 milímetros utilizando MEM suplementado con 20 % de suero bovino fetal. En primer lugar, las células clasificadas aparecen pequeñas, redondas y brillantes tras aproximadamente dos o tres semanas.

Las colonias con fenotipo mesenquimal se vuelven evidentes y la proliferación es más notable para cada preparación celular. Evalúe la capacidad de las CMM pulmonares para diferenciarse en las líneas mesenquimales tradicionales de osteoblasto, adipocito y condrocito, así como su expresión en la superficie celular de marcadores mesenquimales aceptados. Realice un análisis de bandeo citogenético para confirmar la ausencia de anomalías cromosómicas evidentes.

Tras el aislamiento mediante citometría de flujo y la generación de clones de células individuales, se realiza un ensayo de formación de colonias para caracterizar las células MSC y sus capacidades de diferenciación. Comience con células diluidas a tres veces 10 a la cuatro células por mililitro. En medio de cultivo incompleto en placas de 100 milímetros, realice diluciones seriadas de seis veces 10 a la cuatro, tres veces 10 a la cuatro, 1,5 veces 10 a la cuatro y 0,75 veces 10 a la cuatro células por placa en 10 mililitros de medio, en triplicado.

Luego, después de 10 días de cultivo, coloque las placas en el incubador, retire el medio y lave las células con PBS. A continuación, fíjelas añadiendo metanol al 100 % durante cinco minutos a temperatura ambiente. Pasados cinco minutos, retire el metanol.

Luego, para detectar la formación de colonias, agregue gza al 0,4% peso por volumen diluido uno a veinte con agua ionizada e incube de 10 a 15 minutos. A continuación, deseche el colorante y enjuague con agua ionizada. Deje secar las muestras al aire y cuantifique el número de colonias que contienen más de 25 células por colonia utilizando un microscopio invertido o visualización.

Las colonias son grandes y están compuestas por unas pocas cientos de células, como se muestra aquí, y presentan un fenotipo mesenquimal. Las CMM se aislaron como se muestra en este video y se sembraron en placas de 96 pocillos para simular el crecimiento. Luego, se añadieron células presentadoras de antígeno marcadas con CFSE y detenidas al ciclo celular a las CMM pulmonares.

La proliferación de las CMM aisladas se midió entonces como la disminución de la intensidad media de fluorescencia de CFSE en comparación con el fondo, que eran linfocitos T marcados con CFSE solamente, como se muestra en esta figura, en ausencia de C-P pulmonar y en presencia de células presentadoras de antígenos, A PC con y sin albúmina; los linfocitos T efector CD40 positivos muestran una disminución en la intensidad de CFSE, lo que indica proliferación, señalada con círculo rojo. La intensidad de fluorescencia de CFSE en la membrana de los linfocitos T disminuye de forma equimétrica con cada división celular, es decir, a la mitad en cada división; en presencia de C-P-M-A pulmonar con y sin OVA, los linfocitos T efector CD40 positivos no muestran un cambio significativo en la intensidad de CFSE, lo que indica ausencia de proliferación tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de las células madre pulmonares exploraran el papel de las células madre mesenquimales en enfermedades pulmonares como la hipertensión arterial pulmonar y la fibrosis pulmonar.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cinco horas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos de diferenciación, para responder preguntas adicionales, incluyendo si las células madre mesenquimales pulmonares putativas exhiben diferenciación multilínea adecuada y potencial hacia hueso, grasa y cartílago.