¿Por qué la microscopía TIRF mejora la validación de objetivos en estudios de exocitosis neuronal?

La microscopía TIRF excita selectivamente fluoróforos cercanos a la membrana plasmática, permitiendo la visualización directa de eventos de fusión de vesículas. Esto proporciona información mecanicista sobre los blancos que regulan la exocitosis, apoyando la validación funcional en modelos neuronales relevantes para la enfermedad.

¿Cómo contribuye el aislamiento de la membrana plasmática como plano de imagen a los objetivos de la tubería de descubrimiento?

Al restringir la excitación a la onda evanescente, la TIRF aísla eventos cercanos a la membrana, reduciendo el fondo citoplasmático. Esto aumenta la especificidad del ensayo para la exocitosis, permitiendo lecturas más claras en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano.

¿Qué mediciones cuantitativas permite la imagen de TIRF con lapso de tiempo para el análisis de la exocitosis?

La imagen de lapso de tiempo bajo TIRF permite la medición de la frecuencia, el momento y la distribución espacial de los eventos de exocitosis. Estas mediciones cuantitativas permiten el análisis cinético y la evaluación del efecto de compuestos en campañas de cribado.

¿Por qué son importantes la replicación y la estandarización de parámetros para la colaboración interdisciplinaria en ensayos basados en imágenes?

Parámetros de imagen consistentes y replicación garantizan la fiabilidad y comparabilidad de los datos entre usuarios y experimentos. Esto respalda la implementación estandarizada de ensayos en proyectos de descubrimiento con múltiples equipos.

¿Qué capacidades de análisis estadístico se necesitan para interpretar los datos de exocitosis derivados de TIRF antes de su implementación?

Los equipos requieren la capacidad de analizar la frecuencia, el momento y la distribución de eventos utilizando pruebas estadísticas adecuadas. Esto permite tomar decisiones basadas en datos sobre la modulación del blanco o los efectos del compuesto en modelos neuronales.

Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para la visualización de eventos exocíticos

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 vistas • 3:54 min • June 17th, 2025

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Comience con un plato con fondo de vidrio que contenga neuronas corticales embrionarias en una fluorescencia de reflexión interna total o una platina de microscopio TIRF.

Estas neuronas expresan una proteína fluorescente verde sensible al pH o un marcador de vesícula marcado con GFP que emite fluorescencia en pH extracelular neutro pero permanece no fluorescente en vesículas ácidas.

Tras la fusión de vesículas con la membrana plasmática, la exposición al pH extracelular induce fluorescencia, marcando el evento de exocitosis.

Seleccione el objetivo y establezca el índice de refracción para que coincida con la neurona.

Dirija el rayo láser en ángulo con respecto al vidrio, lo que provoca una reflexión interna total y genera una onda evanescente. Esta onda excita selectivamente los marcadores de GFP cerca de la membrana plasmática.

Establezca la profundidad de penetración de TIRF para excluir los marcadores GFP por encima del campo evanescente.

Primero, use iluminación de epifluorescencia de campo amplio para localizar neuronas que expresan GFP.

Luego, cambie a iluminación TIRF para excitación específica de membrana.

Adquiera imágenes de lapso de tiempo para registrar el evento de fusión de vesículas y visualizar la exocitosis.

Después de configurar el microscopio TIRF y la muestra y encontrar un plano focal neuronal de acuerdo con el protocolo de texto, inicie el software láser y conéctese al software de control láser. Establezca la iluminación en campo amplio y seleccione el objetivo. A continuación, establezca el índice de refracción de la muestra y ajuste la intensidad del láser desmarcando el TTL para el láser 491.

La optimización de los parámetros de imagen es importante durante la obtención de imágenes de vesículas exocíticas intactas en el piso para evitar la deriva del enfoque y la fototoxicidad, al tiempo que produce imágenes de alta relación señal-ruido suficientes para el análisis.

Ajuste el control deslizante a 100 y, a continuación, vuelva a bajarlo a un valor entre 20 y 40. Luego vuelva a verificar TTL. A continuación, vuelva a centrarse en la muestra con iluminación de luz transmitida.

Luego, en el software de imágenes, seleccione la iluminación láser 491 y abra el obturador. Coloque el condensador boca abajo en el banco óptico para no rayar la lente. Ajuste con precisión el punto focal del láser en el techo.

Y con el condensador retirado, centre la punta en el centro del diafragma de campo cerrado. Luego reemplace el condensador. Y en el software TIRF, establezca la profundidad de penetración en 110 nanómetros. A continuación, cambie de la iluminación de campo amplio al modo de iluminación TIRF para obtener imágenes.

Ahora, utilizando epifluorescencia de campo amplio, encuentre células que expresan florina VAMP2 a través de los ojos. Luego, para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad, ajuste los parámetros de imagen para maximizar la relación señal-ruido y el rango dinámico utilizando un tiempo de exposición e intensidad láser mínimos. Establezca el enfoque automático continuo por celda. A continuación, adquiera un conjunto de imágenes de lapso de tiempo con la adquisición cada 0,5 segundos durante 5 minutos.