Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

Los dispositivos tal como los preparamos se empaquetan en kits de 10 o 20, y cuando llegan, se envían fríos en una caja, y el kit contiene todos los componentes necesarios para su uso. El experimento en el kit consiste en un paquete con todas las jeringas y tampones, que puede permanecer a temperatura ambiente. También hay una copia del protocolo que vamos a seguir en este experimento.

Además, hay una caja refrigerada que contiene los dispositivos reales y todos los tampones de funcionamiento que deben mantenerse refrigerados. Por lo general, los kits se empaquetan en grupos de 10 o 20. Cuando no se utilizan, los kits deben guardarse en refrigeración.

Cada jeringa y cada componente del kit está etiquetado cuidadosamente, y las etiquetas corresponden a la tabla del protocolo que seguimos. Por lo tanto, no existe ambigüedad sobre qué jeringa o componente del kit debe utilizarse en cada paso. Después de desempacar los dispositivos y colocarlos en una cabina de seguridad biológica, realizaremos el procedimiento de aislamiento de neutrófilos y su lisis para aplicaciones genómicas posteriores, ya que la muestra que obtengamos se utilizará para el aislamiento, o bien, extraeremos el ARN del lisado celular.

Debido a esto, queremos asegurarnos de que nuestra área esté limpia, no solo en el sentido estéril, sino también libre de cualquier ARN presente normalmente en el ambiente. Por lo tanto, es muy importante limpiar toda el área y los dispositivos con una solución que destruya el ARN. Normalmente limpiamos todas nuestras herramientas y superficies de trabajo con RNA SAP o RNAs away, que se pueden obtener de varios fabricantes.

El dispositivo viene empaquetado en una bolsa sellada térmicamente. Cada dispositivo está sellado y codificado con un código de barras. Debe anotar este código de barras si está trabajando con muestras clínicas.

Por lo tanto, el dispositivo está sin sellar, se retira la tapa y se coloca en el manifold de sujeción de la bomba. La muestra de sangre que utilizamos es una muestra de sangre completa. Vamos a hacerla pasar a través de una jeringa estándar de BD de un milímetro, y esta se etiqueta como jeringa uno.

Normalmente, lo que se hace es retirar la jeringa del envase y quitar cuidadosamente la tapa del tubo de sangre. A continuación, se depositan 700 microlitros o 0,7 mililitros de sangre y se inyecta la mitad de esa cantidad, es decir, 350 microlitros, en un tubo de 1,5 mililitros. Gracias. De esta manera, su sangre puede transferirse para un procesamiento posterior.

Su, su tubo de sangre puede transferirse y, sin embargo, aún le queda sangre de reserva en caso de una falla del dispositivo. Entonces, ahora lo que vamos a hacer es cargar la jeringa que contiene sangre, en esta aguja, que está conectada a un tramo de tubo con este dispositivo. Queremos tener mucho, con, con el dispositivo de aislamiento microfluídico.

Queremos tener mucho cuidado para no introducir burbujas de aire en el dispositivo, ya que el dispositivo podría fallar. Por lo general, tomamos la jeringa y empujamos el émbolo, agregando el líquido sobre la superficie superior del dispositivo, asegurándonos de que esté completamente unido antes de expulsar todo el líquido. Detenemos el proceso y retiramos cuidadosamente el cuerpo de la jeringa de la aguja, llenando básicamente la punta de la aguja o el conector de acoplamiento de la aguja con el tampón restante que queda en la jeringa.

Descartamos eso. Luego tomaremos nuestra jeringa con sangre e insertaremos la sangre en este conector tipo luer. Teniendo cuidado de no derramar la sangre y de no introducir burbujas de aire.

Resulta más adecuado utilizar un kemo para sostener el cuerpo de la jeringa y el tubo, por si se derrama algo de sangre. Una vez que la jeringa se conecta al alojamiento del tubo o a la aguja, se golpea varias veces con firmeza para eliminar cualquier burbuja de aire que pueda estar presente en el conector. A continuación, esta jeringa se coloca en la bomba de infusión y se asegura con el tornillo de bloqueo.

Se enciende la bomba de jeringa, que ya está preconfigurada con nuestras condiciones de flujo. Vamos a hacer circular esta sangre a través del dispositivo a 30 microlitros por minuto. Una vez que el cuerpo de la jeringa se carga en la bomba, presionaremos el botón del brazo móvil del émbolo y lo deslizaremos hacia abajo hasta que toque la parte superior del émbolo y comience a expulsar el fluido a través de la punta de esta.

Es una aguja de acero inoxidable con punta roma. Una vez que sepamos que el sistema está cebado, vamos a presionar iniciar. Para comenzar el flujo de sangre, se presiona detener para interrumpirlo y luego se toma un tubo centrífugo limpio de 1,5 ml o un tubo fendor y vamos a desconectar cuidadosamente.

Desconecte solo uno, retire el tubo de uno de los puertos del dispositivo. Una vez que este tubo esté desconectado, lo insertaremos en el tubo fendor de 1,5 mil. Presionaremos "ejecutar" para iniciar nuevamente el flujo sanguíneo.

Y cuando vemos que se forma una gota de sangre, detenemos la bomba e insertamos la sangre en la entrada que acabamos de abrir en el dispositivo. Presionaremos "ejecutar" para iniciar el flujo de sangre y programaremos un temporizador de cinco minutos. Queremos asegurarnos de que la sangre llene de manera uniforme todas las cámaras y de que no haya burbujas de aire evidentes en el dispositivo.

Si hay burbujas de aire que están bloqueando el flujo hacia alguna de las cámaras, puede tomar un par de pinzas y deslizarlas a lo largo de los canales pequeños que conducen a las cámaras de captura o de los canales pequeños que salen de las cámaras de captura. Este dispositivo se está llenando adecuadamente, por lo que después de cinco minutos, presione detener en la bomba de jeringa para interrumpir el flujo de sangre, afloje la abrazadera de la jeringa y retírela del soporte de la bomba de jeringa. Luego, usaremos la jeringa número tres, que está cargada con PBS libre de nucleasas. Vamos a usarla; básicamente, nuevamente nos aseguraremos de que la superficie del dispositivo esté bien acoplada para evitar cualquier burbuja de aire; golpearemos ligeramente la jeringa para asegurarnos de que cualquier burbuja de aire quede en la parte superior del cuerpo de la jeringa.

Suelte el brazo de la bomba de jeringa e inserte la jeringa de tres mililitros en la bomba. Apriétela y luego presione el émbolo hacia abajo hasta que haga contacto con el émbolo de la jeringa. Iniciamos la operación y esperamos a que el líquido cebre el dispositivo; luego aguardamos hasta observar una gota en la punta de la aguja de acero inoxidable.

Cuando vea que se forma una gota, detenga la bomba. Vamos a retirar la sangre, la punta de acero inoxidable que contiene la sangre. Vamos a insertar el tampón de lavado y pulsar ejecutar.

Y vamos a dejar que esto funcione durante cinco minutos. Debe tomar una toallita limpia y limpiar cualquier pequeña cantidad de sangre que pueda estar en la entrada o la salida. Después de cinco minutos de hacer pasar el tampón de lavado a través del dispositivo, este debería haber eliminado completamente cualquier rastro de sangre, lo cual podrá observarse porque no quedará ninguna sangre roja en el dispositivo; el dispositivo se verá transparente. Entonces, lo que haremos después de los cinco minutos es detener el flujo del tampón de lavado.

Y nuevamente, vamos a retirar la jeringa de la bomba de jeringa. Vamos a tapar el tubo microcentrífugo de 1,5 ml directamente en el tubo de salida flexible. Y vamos a levantar cuidadosamente el tubo, el tubo microcentrífugo, sacando el tubo de desecho del dispositivo.

Vamos a desechar eso en un recipiente de bioseguridad. En el kit hay un nuevo tubo de salida, que en realidad está hecho de teflón. Tiene, nuevamente, una punta de acero inoxidable.

Vamos a reemplazar el tubo de salida antiguo por este nuevo tubo de salida. Tomaremos ese tubo de salida y trataremos de doblarlo formando más o menos una forma de U o de V. Además, el kit incluye una columna desintegradora kaya, que corta el ADN y básicamente homogeniza la muestra celular.

Abramos la tapa morada de la columna trituraadora y coloquemos el tubo de salida en la columna Kay Shredder. Sacaremos del kit la jeringa número dos, que indica «para RLT», la cual vamos a utilizar. Es una jeringa estándar BD de un mililitro con punta roma de acero inoxidable de calibre 22.

Vamos a usar eso para inyectar 350 microlitros de RLT estándar de kyogen en el dispositivo. Dado que el dispositivo tiene un volumen muerto de aproximadamente 50 microlitros, lo que queremos hacer es inyectar el RLT, pero detrás del RLT, deseamos inyectar un tapón de aire para liberar ese volumen muerto del dispositivo hacia la columna del triturador chi. Entonces, la forma de hacerlo será tomar nuestra jeringa, aspirar 350 microlitros de aire y luego 350 microlitros o 0,35 mililitros de RLT, y el RLT quedará ahora en la parte inferior de la jeringa.

Resista la tentación de dar vuelta la jeringa e inyectar el aire. El aire está ahí para asegurarnos de que todo el RLT entre en nuestra columna Kay shredder. Vamos a retirar el tubo del tampón de lavado.

Vamos a insertar nuestra jeringa con el RLT y vamos a inyectar lentamente el RLT en el dispositivo durante un período de aproximadamente 30 segundos, asegurándonos de que el tubo de salida expulse sus residuos hacia la columna del triturador Chi. Una vez que comience a inyectarse aire en el dispositivo, presione hacia abajo el émbolo y espere a que todo el líquido se libere en la columna del triturador Kay. Tapamos la columna del triturador Kay y la centrifugamos en una microcentrífuga con equilibrio a 15.000 RPM o a la velocidad máxima de una microcentrífuga de banco durante dos minutos.

Después de centrifugar la columna durante dos minutos, vamos a retirar la muestra, que ahora está en RLT, y la colocaremos en uno de los viales criogénicos con tapón morado suministrados. Si está trabajando con una muestra clínica, etiquete estos viales criogénicos al comienzo del experimento. Aquí está el lisado en el vial criogénico.

Este vial de criogenia se coloca inmediatamente en un congelador a -80 grados centígrados y se almacena para su envío o para la extracción posterior de ARN. Este es, por tanto, un protocolo alternativo para el aislamiento de neutrófilos. En lugar de lisar las células con tampón RLT, las vamos a teñir con un colorante histológico estándar.

Una mancha. Así que sacamos el dispositivo sellado de la bolsa y lo desempaquetamos nuevamente, anotamos el número de lote del dispositivo y colocamos la placa de Petri en el soporte para placas de Petri.

Vamos a tomar la jeringa de un mililitro de su bolsa, jeringa número uno, y la vamos a cargar con 700 microlitros de sangre e inyectar la mitad, 350 microlitros, en un tubo eppendorf DPH. Dejaremos eso aparte. Tomaremos la jeringa cuatro, que tiene el tubo que usaremos para la selección, e inyectaremos la sangre en el dispositivo.

Sujetar la base de la aguja desde la punta del tubo de una manera química. Retirar el cuerpo de la jeringa y llenar el cebo. El adaptador amortiguaría y desecharía esa jeringa.

Insertaremos la jeringa que contiene sangre en la aguja utilizando la toallita química para recoger cualquier derrame. Golpearemos suavemente la jeringa para eliminar las burbujas de aire en la conexión entre la aguja y el cuerpo de la jeringa. Cargaremos la jeringa en la bomba de infusión, y cebaremos la tubería presionando el brazo móvil de la bomba de jeringas.

Desconectaremos el tubo de una de las salidas del dispositivo, el dispositivo de captura, y lo colocaremos en un tubo microfuger de 1,5 ml. Luego, comenzaremos a hacer fluir la sangre pulsando "ejecutar" en la bomba de jeringa. Esperaremos a que se forme una gota de sangre en la punta de acero inoxidable.

Una vez que se forma la gota, presione detener, seque esa sangre, insértela en el dispositivo y presione ejecutar. Ahora configuremos un temporizador de cinco minutos. Bien, después de que fluya a través del dispositivo durante cinco minutos, presione detener en la bomba de jeringa y suelte la jeringa.

Y vamos a reemplazar esa jeringa con la jeringa de tres mililitros que contiene nuestro tampón de lavado, que es solo un XPBS. Nuevamente, queremos asegurarnos de que la parte superior del dispositivo esté sellada y luego vamos a retirar la punta de la aguja que contiene sangre o plus run. Comience a cebado del dispositivo.

Vamos a formar gotas, la insertamos en el dispositivo y pulsamos ejecutar; secamos cualquier sangre en la tubería de entrada o salida y dejamos que fluya durante cinco minutos tras el paso de lavado. Nuevamente, detenemos la bomba de jeringa y retiramos la jeringa del soporte de la bomba. Para realizar un mantenimiento estándar de GIM, primero fijaremos las células y las deshidratamos utilizando metanol al 100 %.

Entonces, tenemos una jeringa, una jeringa de tres mililitros precargada con metanol. Nuevamente, vamos a cebra la jeringa, asegurarnos de que el metanol fluya, detener la bomba de jeringa, insertarla en el dispositivo y pulsar ejecutar. Vamos a fijarlas en esta solución de metanol durante dos a cuatro minutos.

Entonces, después de dos a cuatro minutos de fijación con metanol, detenemos la bomba, retiramos la jeringa con metanol y aquí cargaremos una jeringa de tres mililitros que contiene eem sustain estándar eem sustain de Sigma, diluido uno a cinco en agua desionizada. Después de la dilución, cargamos la mezcla en la jeringa y, en la punta de esta, colocamos un filtro de 0,8 micrones para eliminar cualquier partícula que pudiera obstruir el dispositivo. La tinción dura de cinco a diez minutos.

Luego enjuagaremos con agua desionizada. Después de cinco a 10 minutos de tinción, detendremos la bomba de jeringa y sustituiremos la jeringa que contiene el tampón de tinción por otra que contenga agua desionizada; básicamente realizaremos un lavado hasta observar que el color azul del SAI haya sido eliminado del dispositivo. Una vez que se haya eliminado el exceso de gim sustain del dispositivo, detendremos la solución de lavado.

Luego, vamos a retirar la jeringa de agua de la entrada. A continuación, tomaremos el tubo de salida del dispositivo. Sujetaremos ese tubo en el extremo con nuestras pinzas.

Este es un tubo flexible de tigón y lo vamos a insertar nuevamente en la entrada del dispositivo. Esto sella el dispositivo y mantiene las células hidratadas y su morfología intacta. Ahora mi colega, el Dr. John Hong Chang, mostrará un protocolo alternativo para el aislamiento de linfocitos positivos para CD4, seguido de tinción inmunofluorescente directamente dentro del dispositivo microfluídico.

Mi nombre es Shong Hong y hoy les mostraré la tinción celular en un dispositivo microfluídico. En esta etapa, ya les he mostrado cómo utilizar un dispositivo de aislamiento por inmunoafinidad microfluídico para aislar específicamente células sanguíneas de sangre entera sin precedentes. Con ese fin, desea lisisar las células y obtener el contenido proteico y de ADN a partir de esas células aisladas. Por mi parte, en el contexto de mi investigación, me interesa obtener las células y luego determinar el recuento celular, por ejemplo, obtener el recuento de células CD4 a partir de sangre entera, y utilizarlo como un indicador con fines diagnósticos.

Por lo tanto, el dispositivo utilizado es muy similar al dispositivo de Ken. Está fabricado con una cámara recta de P-D-M-S-A. La geometría es ligeramente diferente, por lo que los parámetros de operación son ligeramente distintos, aunque en general el procedimiento operativo global es muy parecido.

Así que voy a omitir todos los pasos de captura y lavado de células y pasaré directamente al paso de tinción celular en los procedimientos de conteo celular. Aquí tengo un dispositivo en el que ya se han capturado parcialmente células a partir de sangre completa, y el dispositivo ya ha sido lavado con PBS. Las células no retenidas ya han sido eliminadas del dispositivo, y previamente preparé una mezcla de anticuerpos que se utiliza específicamente para etiquetar las células que he aislado dentro del dispositivo.

Por lo tanto, la concentración de anticuerpos que utilizamos aquí ha sido optimizada para teñir las células con una intensidad fluorescente muy alta mediante microscopía de fluorescencia. El procedimiento es bastante sencillo. Cargamos la jeringa llena con la solución de anticuerpos en la bomba de jeringa y luego nos aseguramos de que la velocidad de flujo esté ajustada a los parámetros correctos que necesitamos.

Luego iniciaremos la bomba de jeringa, observaremos el extremo del tubo y nos aseguraremos de que salga la solución para que no queden más burbujas en el tubo. A continuación, podemos conectar el tubo al dispositivo microfluídico en el que tenemos las células capturadas. Ahora el anticuerpo fluye hacia el dispositivo para teñir las células que hemos aislado dentro del dispositivo. La velocidad de flujo aquí es de cinco microlitros por minuto, aunque, dependiendo de la geometría del dispositivo, podrían existir diferentes parámetros de flujo que desee utilizar según su propósito.

Y aplicaremos el flujo de la solución de anticuerpos durante cinco minutos, lo cual es suficiente para reemplazar completamente la solución dentro del canal microfluídico. Por lo tanto, tras la inyección del anticuerpo, detendremos el flujo. Así, haremos circular el anticuerpo a cinco microlitros por minuto durante cinco minutos para reemplazar toda la solución dentro del microcanal.

A continuación, detenemos el flujo y dejamos que el dispositivo incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Esto debe realizarse en la oscuridad para que el anticuerpo no se apague, ya que los anticuerpos fluorescentes pueden apagarse mientras las células incubarán con un anticuerpo marcador. Después de la tinción, que normalmente dura entre 15 y 30 minutos, simplemente desconectamos el tubo del dispositivo y sustituimos la jeringa de anticuerpo por una jeringa de tampón para lavar el anticuerpo no unido del dispositivo.

La solución de lavado contiene aquí 1 % de BSA en solución PBS. La BSA se utiliza para bloquear la unión no específica del anticuerpo sobre la superficie y haremos lo mismo. Primero ajustamos la velocidad de flujo en la bomba de jeringa para asegurarnos de que sea la velocidad deseada, luego iniciamos la bomba de jeringa y verificamos que realmente salga líquido del tubo antes de conectarlo al dispositivo.

El propósito de hacer esto es que no quede ninguna burbuja residual en el tubo. De este modo, cuando inyectamos, ninguna burbuja entra en nuestro dispositivo. Simplemente conectamos el tubo al dispositivo y dejamos que fluya durante otros cinco minutos para reemplazar completamente el lavado y eliminar todo el anticuerpo no unido del dispositivo.

Después del paso de lavado, fijaremos las células con PFA al 1 %. El propósito de hacer esto es que el dispositivo pueda almacenarse durante algunas semanas, aunque es preferible realizar la imagenología de inmediato. El procedimiento es bastante sencillo.

Es similar a lo que hemos hecho anteriormente. Cargamos la jeringa en la bomba, ajustamos la velocidad de flujo a la deseada, luego iniciamos la bomba de jeringa y conectamos el tubo a nuestro dispositivo para inyectar la solución de paraformaldehído, que es el fijador, en nuestro dispositivo para fijar las células. Nuevamente, dejamos que fluya durante aproximadamente cinco minutos.

Entonces, el PFA reemplaza todo el tampón en el dispositivo para fijar todas las células que se encuentran en él. Después del paso de fijación con PFA, simplemente retiramos la jeringa de PFA y el dispositivo ya está listo para la adquisición de imágenes. En algunos casos, las personas desean realizar una tinción del núcleo para mostrarla superpuesta con la tinción de sus marcadores de superficie celular.

Por lo tanto, para ese fin se realizará la tinción del núcleo utilizando DPI al final. Así que simplemente cargamos la jeringa con DPI, encendemos la bomba de jeringa y hacemos fluir el DPI hacia nuestro dispositivo. Ahora los núcleos quedarán teñidos en esas células para mostrar la ubicación de las mismas.

Y esta imagen de tinción con DPI puede superponerse posteriormente con la tinción del marcador de superficie para mostrar la ubicación de las células. Por lo tanto, al final de la tinción con DPI, debemos volver a lavar el DPI L band con la solución tampón. Nuevamente, utilizamos PBS que contiene 1 % de BSA para eliminar el DPI no ligado.

Y el procedimiento es similar a lo que hemos hecho anteriormente. Simplemente conectamos la jeringa de tampón al dispositivo y permitimos que el tampón fluya a través del dispositivo para eliminar el dap no unido. Ese es todo el procedimiento para teñir células en un dispositivo microfluídico.

Y tras todos los procedimientos de tinción, los dispositivos están listos para la obtención de imágenes. Y debido a que se realizó la fijación con PFA, los dispositivos también pueden almacenarse durante algunas semanas si la obtención de imágenes no se puede realizar de inmediato.