De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Hola, soy Kara Ted, yo soy Leo. Adelante conmigo. Y yo soy Simon McQueen Mason.

La digestibilidad de la biomasa vegetal es un tema de gran interés en la actualidad. Esto se debe a que existe una gran cantidad de azúcares atrapados en los polisacáridos de las paredes celulares vegetales que componen dicha biomasa, y si logramos liberar esos azúcares en una forma utilizable, podemos fermentarlos para producir todo tipo de productos, como combustibles y productos químicos. Desafortunadamente, estos materiales son extremadamente difíciles de digerir, y comprender mejor qué controla su digestibilidad es un asunto de cierta urgencia.

Por lo tanto, para poder utilizar material vegetal en la producción de grupos renovables, necesitamos ser capaces de medir el potencial de fificación en estas plantas. Aquí, en la Universidad de York, estamos analizando grandes poblaciones de material vegetal para determinar su potencial de fificación. La fificación es el proceso de descomponer carbohidratos complejos en sus componentes de monosacáridos para producir productos químicos valiosos mediante diferentes procesos industriales.

Para medir el potencial de fermentación, reproducimos procesos industriales a escala microscópica, en los que sometemos la biomasa a un pretratamiento e hidrólisis enzimática para determinar los azúcares liberados. Esto permite identificar variedades interesantes en genotipos. El sistema de alto rendimiento funciona en un formato de placa de seis pocillos IG.

Se utilizan condiciones suaves de hidrólisis para exponer diferencias sutiles entre genotipos, y también es lo suficientemente flexible como para admitir diferentes materiales sustrato y evaluar distintas enzimas. El método que utilizamos implica la preparación del material vegetal en forma de polvo, que luego se pretrata con un ácido o álcali diluido a 90 grados durante 20 minutos. A continuación, se realiza una digestión enzimática utilizando una mezcla comercial de celulasa a 50 grados durante ocho horas.

Finalmente, se utiliza un método MBTH para determinar la liberación de azúcares reductores. El material vegetal se cosecha como tallos secos, que se cortan en segmentos de cuatro milímetros. Estos se colocan en viales de dos mililitros junto con tres bolas metálicas de cinco milímetros.

Los viales están etiquetados individualmente con códigos de barras, que se escanean para garantizar la trazabilidad de las muestras. Las muestras se cargan en los robots de molienda y acondicionamiento dentro de los robots. Las muestras se muelen y mezclan automáticamente para permitir la dispensación de la biomasa en una placa de 96 pocillos.

Los viales son perforados, luego se reposiciona el vial en el brazo robótico de manera que quede colocado dentro de un embudo que vibra para dispensar el polvo. La vibración del embudo se regula mediante una balanza para alcanzar la cantidad objetivo por masa por pocillo que se dispensa. La biomasa se dispensa en 10 columnas de las placas, dejando dos columnas para los estándares.

Al realizar cuatro repeticiones por muestra, cargamos 20 muestras por placa. El hidrolizado de esta placa se triplicará en placas de PCR, resultando en tres placas ópticas. De esta manera, tenemos tres determinaciones de azúcares reductores por pocillo de biomasa.

Una vez preparadas, las placas se sellan con una lámina de silicona para evitar la evaporación. Cuando están listas, se trasladan al robot de manipulación de líquidos. En el robot de manipulación de líquidos, el pretratamiento, la hidrólisis enzimática y la determinación de los azúcares liberados se realizan automáticamente.

La mesa de dos metros tiene contenedores para los diferentes reactivos necesarios, así como espacio de almacenamiento para el material plástico. Hay incubadoras para la pretratamiento e hidrólisis, así como termocicladores para la determinación de azúcares. El pretratamiento se realiza en la placa de pocillos profundos.

Mediante la adición de soluciones diluidas de ácido o alcalinas al polvo de biomasa. Las placas se transfieren al bloque calefactor y se incuban a 90 grados durante 20 minutos. Una vez finalizada esta incubación, el pretratamiento se elimina lavando cinco veces con 500 microlitros de tampón acetato.

Una vez que se ha eliminado el pretratamiento mediante lavado, se añade un cóctel enzimático. Es una mezcla estándar que contiene celulasa y una novozima 1, 8 8 en una proporción de cuatro a uno, con una concentración de siete FPU por pocillo.

Las placas se incuban durante ocho horas a 50 grados bajo agitación. Se transfiere 75 microlitros del hidrolizado resultante a una placa de PCR. En las columnas 11 y 12 de las placas de PCR, se añaden los patrones de glucosa.

A continuación, se agregan 25 microlitros de hidróxido de sodio uno molar a todos los pocillos. Finalmente, se pipetean 50 microlitros del reactivo MBTH en la placa de PCR. La placa de pocillos profundos se almacena tras completar la transferencia del hidrolizado a la tercera placa de PCR.

Mientras tanto, las placas de PCR se trasladan a los termocicladores para la incubación a 60 grados durante 15 minutos. El paso final del proceso es la transferencia de la mezcla de reacción a placas ópticas para el desarrollo del color. Tras la incubación, se retiran las placas de PCR del termociclador.

Se añaden cien microlitros de reactivo oxidante a la mezcla de reacción transferida. Para facilitar el desarrollo del color, el proceso de manipulación de líquidos se realiza cuatro veces en 24 horas, donde el enjuague previo al tratamiento y la adición de enzima toman aproximadamente dos horas. La hidrólisis enzimática dura ocho horas, y la determinación del azúcar requiere otras dos horas.

Mientras la primera placa se incuba durante ocho horas, la siguiente placa comienza el proceso. Con esta asignación de recursos robóticos, se logra un rendimiento de tres tandas de 80 muestras por día para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados. Las placas ópticas se leen a 620 nanómetros.

Los resultados que se obtienen se analizan para cuantificar los azúcares liberados como nanomoles por miligramo por hora de reacción. Gracias por ver este video y espero que esto inspire su investigación en biocombustibles.