Video-velocidad de barrido y microscopía confocal Microendoscopy

Este video demuestra cómo construir un microscopio confocal de barrido a velocidad de video utilizando componentes estándar disponibles en el mercado. Un microscopio confocal de barrido depende del movimiento coordinado de dos espejos de barrido para desplazar el haz a través del plano raster; la luz proveniente del primer espejo se escanea horizontalmente a través del primer conjunto de lentes de relevo, que la enfoca nuevamente en un punto estacionario sobre el segundo espejo de barrido. Luego, este mismo movimiento de barrido se transmite a través de las lentes de escaneo y del tubo, colocando el haz de luz ya ampliado en la abertura trasera de la lente del objetivo.

El segundo espejo, cuyo movimiento es lento en comparación con el primer espejo, escanea simultáneamente el eje Y, permitiendo la acción de escaneo por encima y por debajo del plano ilustrado y creando un raster rectangular sobre la superficie de la muestra. La principal ventaja de este protocolo frente a la compra de un microscopio comercialmente disponible es su bajo costo y la posibilidad de personalizar el instrumento según las necesidades específicas de un proyecto de imagen. Al trabajar con cualquier láser, es fundamental tomar las medidas de seguridad adecuadas para prevenir lesiones oculares.

Asegúrese de usar gafas de seguridad para láser adecuadas siempre que sea posible. Los espectadores y/o investigadores que no estén alineando ni trabajando activamente con el haz deben usar gafas en todo momento. Retire todos los relojes y joyas brillantes o reflectantes.

Lo más importante es asegurarse de seguir y controlar el haz en todo momento, terminando su trayectoria con un bloqueador de haz o una tarjeta de presentación montada. Esto es especialmente importante al alinear los espejos, ya que la trayectoria del haz puede ser difícil de predecir. Además, nunca coloque sus ojos al nivel de la trayectoria del haz.

Apague el láser si necesita cruzar el plano del haz antes de armar el microscopio. Asegúrese de que todo el equipo necesario para la construcción esté disponible, incluyendo la plataforma óptica y los soportes en ángulo de 90 grados, todos los espejos, lentes y el divisor dicróico, junto con las abrazaderas y los accesorios de montaje adecuados, ambos espejos de barrido y el detector fotónico. También es útil tener a mano un generador de funciones para probar la acción de barrido y manipular los espejos durante la alineación.

También se recomienda encarecidamente fijar la placa de pruebas con tornillos para mayor estabilidad. Comience la construcción del microscopio colocando la fibra con conector en el soporte óptico y coloque este conjunto en el centro de la placa de pruebas óptica. Esto corresponde al origen del haz azul tal como se muestra aquí.

Encienda la fuente de luz. Utilice los tornillos de ajuste para ajustar aproximadamente el haz de manera que viaje en línea recta tanto horizontal como verticalmente. Coloque un diafragma delante del colimador de fibra.

A continuación, ajuste la altura del diafragma para que el haz pase por el centro. Luego mueva el diafragma alejándolo del ator a lo largo del trayecto del haz. Verifique la alineación del haz.

Utilice los dos tornillos de ajuste para reposicionar el haz sobre el diafragma si es necesario. Coloque el espejo diic montado en la trayectoria del haz con el haz láser posicionado en el centro del espejo. Gire el soporte del espejo para reflejar el haz aproximadamente a 90 grados, asegurándose de que la altura del haz no cambie.

Sujete el espejo a la mesa apretando los tornillos del soporte. A continuación, coloque el espejo galvanométrico resonante montado en la trayectoria del haz láser. Tenga cuidado de asegurar que el haz láser esté posicionado exactamente en el centro horizontal de la superficie del espejo.

Gire el soporte del espejo para reflejar el haz láser a un ángulo de 90 grados. Luego, ajuste aproximadamente el reflejo del espejo para mantener la misma altura vertical del haz láser. A continuación, tome dos iris y colóquelos directamente frente al galvanómetro resonante.

Luego, utilizando el haz láser reflejado en el espejo galvo resonante como referencia, ajuste su altura vertical como antes. Ahora, usando los orificios roscados en la mesa óptica como guía visual, sujete los dos diafragmas en línea recta. Ajuste el primer espejo en la trayectoria, que es el dicróico, para centrar el haz en el primer diafragma.

Luego ajuste el segundo espejo en el recorrido. Utilice el galvanómetro resonante para centrar el haz en la segunda iris. Ajuste iterativamente estos dos espejos hasta que el haz esté alineado a través de ambas iris.

Asegúrese de que el haz láser reflejado por el espejo galvanométrico resonante siga siendo reflejado desde el centro aproximado del espejo. Si el haz está desviado, ajuste el soporte del colimador de fibra y repita los ajustes con el haz centrado en ambas iris abiertas. El siguiente paso consiste en colocar las dos lentes de relevo que proyectarán el primer plano telecéntrico estacionario sobre el segundo plano telecéntrico estacionario.

Para este microscopio en particular, las lentes seleccionadas en el primer relé tienen la misma longitud focal F, por lo que la distancia entre los dos espejos aquí es simplemente cuatro F. Para este montaje, F equivale a 90 milímetros, por lo que la posición cuatro F estará a 360 milímetros del espejo de barrido. Para asegurar que las lentes estén perfectamente centradas en la trayectoria del haz, coloque la primera lente en la trayectoria del haz y observe el punto del haz láser en el siguiente diafragma en la trayectoria del haz. Tras la lente, ajuste la altura de la lente de modo que el centro vertical del haz coincida con el centro del diafragma.

A continuación, ajuste la posición horizontal del haz para centrar el haz en la pupila. Repita este proceso con la segunda lente. A continuación, se configurará el espejo de barrido y se rotará el microscopio para facilitar la colocación y alineación directas de las piezas que de otro modo necesitarían ajustes verticales.

Para encontrar la posición exacta del segundo plano telecéntrico, conecte el galvanómetro resonante en su unidad de escaneo y enciéndalo. Utilice una tarjeta de presentación para seguir la trayectoria del haz de escaneo a través de las dos lentes. El segundo plano telecéntrico se ubicará aproximadamente a cuatro F del galvanómetro residente y puede identificarse como el punto donde el haz de escaneo parece permanecer estacionario.

Marque con un lápiz la protoboard debajo de esta ubicación. Una vez identificado el plano telecéntrico, configure la entrada del espejo de barrido en cero voltios y encienda el hardware de control del espejo para que el espejo alcance su posición neutra. Luego, coloque el espejo galvanométrico estándar de barrido exactamente en la ubicación del plano tele.

Ajuste la posición del espejo de manera que el haz en el plano tele golpee exactamente el centro del espejo de escaneo y apriete el soporte del espejo. Ahora afloje el tornillo de fijación que sostiene el espejo galvanométrico y gírelo, asegurándose de que el haz se propague verticalmente. Ahora apague el láser y la electrónica de escaneo.

Desconecte la fibra y desconecte los espejos de escaneo. Luego, utilizando soportes de montaje de placa de 90 grados, fije la segunda placa a la primera.

Finalmente, gire cuidadosamente todo el microscopio de modo que la nueva placa base quede plana y use la abrazadera para asegurar el microscopio en su posición. Vuelva a conectar aquí el gal o y el láser, y recuerde devolver el gal O a cero voltios. El resto del montaje anteriormente vertical se puede realizar fácilmente sobre la placa base plana.

A continuación, configuraremos el segundo conjunto de lentes de relevo, denominado formalmente lente de escaneo y lente tubular. Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener información muy importante sobre la selección de la combinación adecuada de lentes. Comience por configurar las lentes.

Primero, coloque los espejos necesarios para dirigir el haz hacia la lente objetivo. Coloque el primer espejo grande de dos pulgadas cerca del borde de la placa base y gire el soporte del espejo para reflejar aproximadamente 90 grados el haz láser. Ajuste el reflejo en el espejo para mantener la misma altura vertical del haz.

Luego, coloque el otro espejo de dos pulgadas en el borde opuesto de la placa óptica para desviar el haz en un ángulo de 90 grados y utilice los tornillos de ajuste para fijarlo en su lugar. A continuación, configure dos irises y ajuste los dos espejos como antes para centrar el haz. Luego, coloque la lente de escaneo a su distancia focal desde el galvanómetro en la trayectoria del haz y ajuste su posición horizontal y vertical.

Para centrar el punto láser en la primera iris entre los dos espejos. Coloque cuidadosamente la lente tubular grande de dos pulgadas a la distancia adecuada de la lente de escaneo y ajuste su posición horizontal y vertical para centrar el haz en la primera iris. En este montaje, la lente tubular se coloca a una distancia de 75 milímetros más 300 milímetros con todos los componentes en su lugar.

Conecte el galvanómetro O a la salida de un generador de funciones eléctricas estándar o circuito de control, y ajuste los voltajes de pico a pico a entre uno y tres voltios. Luego, comience a escanear los dos espejos utilizando una tarjeta de presentación. Localice el haz láser en el plano estacionario, a 300 milímetros después de la lente tubular.

Coloque el objetivo en la trayectoria del haz, asegurándose de posicionar la abertura posterior del objetivo lo más cerca posible del plano estacionario. Configure la platina de la muestra, asegurándose de que el montaje trasladable del eje Z no choque con el montaje del objetivo mientras se desplaza a lo largo de su rango. Para configurar el confocal, comience por desconectar todas las fuentes de alimentación y las fibras ópticas del diafragma y del detector.

Gire el conjunto del microscopio de manera que vuelva a reposar sobre la placa de montaje, sosteniendo el espejo de escaneo resonante. Después de reconectar la fibra al colimador y al espejo de escaneo estándar, así como los cables de alimentación, suministro y control, aplique cero voltios al voltaje de control que acciona el galvanómetro de escaneo estándar como antes en la platina, coloque una muestra de un colorante brillante entre dos cubreobjetos. Luego encienda la fuente láser y enfoque el colorante.

Ajuste la potencia del láser para hacer que la fluorescencia sea lo más brillante posible utilizando una tarjeta de presentación. Siga la emisión fluorescente desde la muestra a través del objetivo, pasando por el sistema de escaneo hasta el espejo dicróico, que refleja el haz láser y transmite la emisión fluorescente. Localice esta señal fluorescente en el otro lado del espejo dicróico.

Ahora atenúe las luces de la habitación. Coloque un espejo detrás del espejo dicromático para reflejar la emisión en un ángulo de 90 grados. Luego, utilizando un diafragma con un espejo, dirija el haz de fluorescencia lo más recto y paralelo posible a la base óptica.

A continuación, se configurará la unidad de diafragma confocal utilizando el conjunto de montaje con porta-filtros espaciales de Thor Labs. Este diagrama describe la configuración. El espejo de barrido se sitúa en planos estacionarios que están conjugados telescópicamente con un objetivo estacionario.

Los pares de lentes en el plano de la abertura posterior entre los planos estacionarios actúan para retransmitir los haces escaneados. El primer par de lentes tiene una longitud focal igual, formando un telescopio uno a uno. El segundo par de lentes, conocido formalmente como lente de escaneo y lente tubo, no necesita tener longitudes focales iguales y a menudo sirve como un telescopio amplificador de haz para asegurar que la abertura posterior del objetivo esté sobrealimentada.

La luz emitida por la muestra viaja de regreso a través del sistema de escaneo y atraviesa el espejo dicróico. Una lente de enfoque corto o una lente objetivo enfoca la luz de emisión a través del orificio confocal, la cual luego es colimada por una lente. Una lente final enfoca la emisión filtrada confocalmente sobre un tubo fotomultiplicador.

Coloque la unidad de filtro espacial en línea con la trayectoria del haz de emisión, teniendo cuidado de centrar el soporte de la primera lente de enfoque sobre el haz de emisión. En este caso, se seleccionó una unidad de filtro espacial con un tamaño de orificio de 100 micrones. A continuación, monte una lente de distancia focal corta en la unidad y deslice el soporte de traslación en Z hasta que se observe un enfoque claro sobre la superficie del orificio.

Asegúrese de que toda la unidad esté orientada a lo largo de la línea recta definida por el haz fluorescente. Sujete la unidad a la placa base. Ahora, utilizando los botones de ajuste del escenario de traslación, ajuste los dos ejes para realizar una búsqueda bidimensional sobre la superficie del soporte del diafragma y encontrar el punto en el que la señal fluorescente a través del diafragma sea máxima.

A continuación, coloque la lente de recubrimiento en el soporte de jaula. Después del orificio de aguja, utilice una tarjeta para localizar el ion fluorescente que pasa a través de la unidad confocal y deslice la lente de recubrimiento a lo largo de los postes hasta que la fluorescencia emitida esté lo más colimada posible. Configure el conjunto del tubo fotomultiplicador. Coloque una lente de longitud focal de 50 milímetros en la trayectoria del haz de emisión fluorescente y encuentre su punto focal.

Marque esta posición en la placa de pruebas. Ahora apague completamente el láser y coloque el tubo fotomultiplicador de manera que su ventana quede lo más cerca posible del punto focal marcado. Luego, utilizando tubos de lentes ajustables, conecte el conjunto a la lente de enfoque.

Envuelva con cinta oscura todos los trayectos del haz expuestos tras el orificio, encienda el láser manteniendo su potencia extremadamente baja. Encienda el tubo fotomultiplicador leyendo cuidadosamente su voltaje en el osciloscopio. A medida que se incrementa la intensidad del láser, aumente el voltaje hasta que se observe en la pantalla del osciloscopio una señal en forma de pico o un desplazamiento de corriente continua (DC).

Confirme que esta señal proviene efectivamente de la fluorescencia apagando la potencia del láser o bloqueando la trayectoria del haz para observar la pérdida de señal. Finalmente, alinee iterativamente el diafragma para obtener la señal máxima en el osciloscopio. Manipulando primero la posición Z de la lente de enfoque y luego ajustando la etapa de traslación YZ, el hardware del microscopio de velocidad de video queda completo.

Primero, apague el tubo fotomultiplicador. Ahora conecte los espejos, las placas de control personalizadas y la computadora según se muestra en el protocolo escrito adjunto. Este sistema puede adaptarse para realizar microendoscopia confocal de barrido.

Al reemplazar la platina con una platina de sujeción de fibra, consulte el texto adjunto o los detalles. El microscopio confocal de barrido vertical terminado y el microendoscopio deben aparecer como se muestra aquí. Los haces láser y de emisión se han dibujado como una guía para el ojo.

Durante la operación de microendoscopia, un soporte para fibra mantiene la fibra de imagen en su lugar durante los experimentos. Este soporte para fibra puede reemplazarse fácilmente con una platina XY para diferentes usos. Una plataforma de microscopio vertical mostrada aquí es una imagen representativa tomada de una letra M minúscula impresa en una tarjeta blanca, utilizando una tarjeta capturadora de cuadros a velocidad de video para generar imágenes a partir de la señal entrante. Decolorado.

El papel blanco contiene fluoróforos que se excitan fácilmente con luz UV y azul, lo que produce un fondo brillante detrás de la oscuridad. Se eligió la letra M y un filtro de emisión centrado en 515 nanómetros para recoger esta emisión fluorescente. Puede observarse una leve distorsión de la imagen, especialmente cerca de los bordes laterales del marco de la imagen.

Esta distorsión resulta del patrón de escaneo sinusoidal del espejo gvo de ocho kilohercios y se analiza en detalle en el documento adjunto. Esta película muestra datos a velocidad de video obtenidos al escanear una tarjeta de presentación. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo construir y alinear un microscopio confocal de escaneo a velocidad de video.

No olvide que trabajar con luz láser puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como retirar todas las joyas reflectantes y evitar trabajar con los ojos al nivel del trayecto del haz al realizar este procedimiento.