La visualización de la función respiratoria mitocondrial utilizando citocromo C Oxidasa / Succinato Deshidrogenasa (COX / SDH) de doble etiquetado Histoquímica

El objetivo general de este procedimiento es permitir la visualización directa de deficiencias enzimáticas respiratorias mitocondriales en secciones de tejido congelado fresco. Esto se logra primero mediante la obtención de secciones criostáticas del órgano de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar la histoquímica de COX, que va seguida de la histoquímica de SDH.

Finalmente, las secciones de tejido se deshidratan, montan y cubren con láminas de cubreobjetos. En última instancia, los resultados pueden mostrar la cantidad de disfunción mitocondrial mediante la intensidad de la tinción azul celular. Hola. Hoy vamos a hablar sobre la técnica histológica de doble marcado COX-SCH.

Y aunque este método puede aplicarse para estudiar enfermedades mitocondriales, también puede proporcionar información sobre el envejecimiento y los trastornos relacionados con la edad. Después de extraer el cerebro de un animal que ha sido sacrificado de acuerdo con el permiso ético, congélelo rápidamente en hielo seco. El tejido congelado puede conservarse a menos 80 grados Celsius, envuelto en papel de aluminio, hasta que esté listo para seccionarlo.

Prepare el tejido para la criosección colocando el cerebro sobre una platina del criostato y rodeándolo con compuesto de inclusión. Coloque rápidamente la platina en el criostato y recopile secciones de 14 micrones a menos 21 grados Celsius. Derrita las secciones sobre portaobjetos utilizando un bloque calefactor y luego deje secar los portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora.

Coloque los portaobjetos en una cámara de tinción para portaobjetos con tiras de papel húmedo. Dado que los tiempos de reacción son importantes en este ensayo, se recomienda procesar un máximo de 10 portaobjetos por experimento bajo una campana extractora. Prepare el medio de incubación que contenga DAB y citocromo C en tampón PBS y mezcle mediante vortex.

Agregue rápidamente dos microgramos de CDE bovinos al medio y mezcle bien mediante vortex. Para desagregar todos los gránulos de CDE que aún estén activos bajo la campana, aplique entre 150 y 200 microlitros de medio de incubación a cada portaobjetos utilizando la punta de pipeta para distribuirlo uniformemente sobre todas las secciones. Incube los portaobjetos durante 40 minutos a 37 grados Celsius.

Después de 40 minutos, retire el medio de incubación de los portaobjetos. Lave los portaobjetos cuatro veces con PBS durante 10 minutos cada vez. Después de lavarlos, devuélvalos al recipiente para tinción de portaobjetos con tiras de papel húmedas, trabajando bajo una campana química.

Prepare la solución de NBT en PBS, teniendo cuidado de proteger el PMS de la luz; vortexe rápidamente la solución y aplique de 150 a 200 microlitros de la solución de NBT a cada portaobjetos, utilizando la punta de pipeta para distribuirla uniformemente sobre todas las secciones. Incube los portaobjetos durante 40 minutos a 37 grados Celsius; transcurridos los 40 minutos, retire el exceso de solución de los portaobjetos. Lave los portaobjetos cuatro veces en PBS durante 10 minutos cada vez.

Deshidrate las laminillas durante dos minutos cada una en las siguientes concentraciones secuenciales de etanol: 70%, 70%, 95%, 95% y 99,5%. Finalmente, deje durante 10 minutos en un paso adicional con 99,5%. Coloque las laminillas en xileno durante 10 minutos, monte con LAN y coloque las cubreobjetos.

Deje que los portaobjetos sequen durante la noche o al menos de una a dos horas en un área ventilada aquí. Las secciones cerebrales de ratones de tipo salvaje y ratones Mutator de ADN mitocondrial con envejecimiento prematuro se etiquetaron secuencialmente para las actividades de COX y SDH.

La actividad normal de Cox indicada por la tinción marrón oscuro se observa en el hipocampo de ratones de tipo silvestre. Las deficiencias de Cox indicadas por la tinción azul se revelaron en el hipocampo de ratones mutadores de ADN mitocondrial a las 12 y 46 semanas. Hubo una disminución adicional de la actividad de Cox a las 46 semanas de edad en ratones mutadores M-T-D-N-A, lo que sugiere una exacerbación generalizada de la disfunción de la cadena respiratoria.

Incubaciones inadecuadas de 10 y 25 minutos resultaron en una deposición reducida del producto de reacción marrón de DAB. Los tiempos acortados de incubación permitieron la formación del producto final azul de Foran durante la incubación de SDH, lo que sugería erróneamente la presencia de células con deficiencias de COX durante el cubrimiento. Las laminillas durante la incubación de COX también provocaron una formación y deposición inexacta del producto de reacción de DAB.

Aunque las actividades de Cox y SDH se pueden marcar individualmente como se muestra aquí, el marcado secuencial ha demostrado ser ventajoso para localizar células con disfunción mitocondrial. Un ejemplo de control de especificidad para las actividades de COX y SDH en cerebro de un ratón tipo salvaje muestra un marcado negativo. Por lo tanto, no olvide que trabajar con los productos químicos en el protocolo químico de doble marcado de Cox y SDH es extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como usar ropa de laboratorio adecuada y mascarilla, trabajar bajo la campana extractora de gases, y desechar el medio de incubación cada vez que realice este ensayo.