Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener progenie neuronal directa y exclusivamente a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes mediante la inducción con moléculas pequeñas. Esto se logra añadiendo ácido retinoico a células indiferenciadas mantenidas en condiciones definidas. A continuación, el proceso de diferenciación continúa separando las células en un cultivo de suspensión, donde forman cúmulos celulares flotantes denominados neuroblastos.

Si se permite que los neuroblastos se adhieran a una placa de cultivo de tejidos en medio de diferenciación neuronal, desarrollan características de neuronas maduras. En última instancia, la inmunofluorescencia y la microscopía de desconvolución o confocal pueden utilizarse para mostrar el efecto del tratamiento con ácido retinoico en la morfología y la expresión de marcadores de las células madre embrionarias humanas tratadas. En otras técnicas, solo una pequeña fracción de células adopta un fenotipo neuronal, mientras que nuestro método permite una inducción eficiente y bien controlada de células madre embrionarias humanas pluripotentes exclusivamente hacia una línea neuronal mediante la simple adición de moléculas pequeñas.

Hay algunos pasos con los que hay que tener cuidado al preparar soluciones madre. Tenga cuidado de descongelar lentamente el Matrigel y la laminina humana pasándolos de menos 80 grados Celsius a cuatro grados Celsius durante la noche, almacene los medios a cuatro grados Celsius y siempre caliente los medios a 37 grados Celsius antes de usarlos. Además, al preparar los medios humanos ESL, algunos suplementos se agregan justo antes de su uso.

Estos incluyen BFGF, ácido ascórbico, insulina humana activa en A y transferrina. A continuación, prepare inmediatamente antes del recubrimiento de las placas la gelatina matrigel o las soluciones trabajadoras de laminina humana. Incube las placas a 37 grados SIUs en 5 % de dióxido de carbono después de que se hayan preparado las placas de cultivo tisular pre-recubiertas con gelatina.

La gelatina puede sustituirse por la solución de trabajo de matrigel o laminina. Recubra estas placas incubándolas durante la noche a cuatro grados Celsius. Comience permitiendo que las colonias de células madre embrionarias humanas crezcan durante cinco a siete días y luego prepárese para dividirlas.

Seleccione colonias con más del 75 % de células indiferenciadas en cultivos de células ES humanas. Por lo general, estas colonias son ligeramente opacas, con bordes definidos y contienen células apiladas. Un indicio del inicio de la diferenciación suele ser la aparición de colonias blancas; las colonias que contienen principalmente células diferenciadas suelen ser transparentes. No seleccione colonias blancas ni transparentes.

Sostenga las placas frente a la luz y utilice un marcador para delinear las colonias ligeramente opacas en la parte inferior de las placas siguiendo sus contornos. Use el borde de una punta estéril para pipeta P2 para separar la capa de fibroblastos circundante de la colonia de células madre embrionarias humanas. A continuación, retire las células de fibroblastos circundantes y también elimine todas las partes diferenciadas de la colonia.

Ahora aspire el medio antiguo que contiene las células diferenciadas desprendidas. A continuación, lave una vez las células indiferenciadas en cada pocillo con medio para células madre humanas E que carece de BFGF, y luego agregue tres mililitros de medio fresco para células madre humanas ESL que contiene B-F-G-F; el B-F-G-F se añade al medio fresco inmediatamente antes del uso. Ahora utilice una punta estéril para pipeta P2 para cortar las colonias en pequeños fragmentos y desprenderlas de la placa.

Aspirar los fragmentos de colonia separados junto con su medio hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Aspirar un mililitro adicional de medio por cada pocillo como enjuague.

Las células ya están listas para una diferenciación adicional mediante el uso de moléculas pequeñas. Comience calentando las placas recién recubiertas a 37 grados Celsius. Aspire la solución de recubrimiento de las placas y agregue un alícuota de cuatro mililitros de medio que contenga fragmentos de colonias en cada pocillo; luego transfiera suavemente las placas al incubador sin agitarlas.

No perturbe las placas para permitir que se realice la siembra. Después de tres días de siembra, prepare un medio nuevo que contenga ácido omíc. Luego, retire la mayor parte del medio antiguo, dejando solo suficiente medio para que las células permanezcan sumergidas.

Las células nunca deben secarse. Añada cuatro mililitros de medio fresco para células ES humanas con BFGF y ácido retinoico. Cambie el medio cada dos días y permita que las colonias de células ES humanas tratadas con ácido retinoico crezcan.

Después de siete u ocho días, las células habrán sufrido cambios morfológicos y se habrán convertido en células grandes y diferenciadas. A continuación, proceda a preparar un cultivo celular en suspensión; para iniciar el cultivo en suspensión, desprenda las colonias de ESL de las células que se han diferenciado espontáneamente y migrado hacia afuera formando una capa de fibroblastos. Utilice la técnica mencionada anteriormente con una punta estéril de pipeta y luego aspire el medio antiguo que contiene los fibroblastos desprendidos en suspensión.

Lave las células una vez con medio HESC y resuspenda las células en tres mililitros de medio HESC. Ahora, utilizando una punta de pipeta estéril P2, corte las colonias en trozos pequeños y despréndalas de la placa.

Recolecte el medio con colonias desprendidas en un solo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague los pocillos con un mililitro de medio y añada el enjuague al medio recolectado. Luego, distribuya cuatro mililitros del medio celular recolectado en cada pocillo de una placa de seis pocillos con adherencia ultra baja durante cuatro a cinco días, y mantenga la placa en un incubador.

Durante este tiempo, se formarán agrupaciones celulares flotantes o neuroblastos que permitirán que el neuroblasto progrese hacia un fenotipo neuronal más maduro. Aspirar el medio que los contiene hacia un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 1.400 RPM durante cinco minutos.

Aspire, pese la mayor cantidad posible del medio antiguo y agregue una cantidad igual de medio NSC fresco que contenga VEGF N NT tres y BDNF. Suspenda las células mediante pipeteo y luego distribuya cuatro mililitros de la suspensión por pocillo en placas de cultivo celular de seis pocillos. Transfiera las placas a un incubador húmedo a 37 grados Celsius.

El neuroblasto se adherirá a las placas de cultivo durante la noche para un cultivo 3D en Matrigel o laminina humana añadida a la suspensión de neuroblastos. Y una matriz 3D se polimerizará a 37 grados Celsius. Reemplace el medio cada dos días.

En el transcurso de dos semanas, aparecerán extensas redes de células neuronales que portan neuritas y células pigmentadas. El ácido retinoico es suficiente para inducir que las células ES humanas mantenidas en el sistema de cultivo definido transicionen de la pluripotencia exclusivamente hacia un fenotipo neuroepidermal. Tras la exposición de células ES humanas indiferenciadas al ácido retinoico, todas las células dentro de la colonia experimentaron cambios morfológicos convirtiéndose en células diferenciadas grandes que dejaron de expresar el marcador asociado a la pluripotencia OCT4. Las células también comenzaron a expresar diversos marcadores asociados al neuroectodermo, tales como HNK-1a, P2 y TRKC.

Estas grandes células diferenciadas continuaron multiplicándose y las colonias aumentaron espontáneamente de tamaño, expresando el marcador neuronal temprano beta tres tubulina. El marcador neuronal más maduro map dos comenzó a aparecer en áreas de las colonias donde las células se habían acumulado. Coincidentemente con la aparición de las células neuroectodérmicas, el factor de transcripción específico neuronal NER uno, implicado en la diferenciación neuronal dopaminérgica y en la activación del gen de la tirosina hidroxilasa, se translocó hacia el núcleo.

Tras la disociación, las células ES humanas tratadas con ácido retinoico formaron neuroblastos en cultivo de suspensión tras la eliminación del FGF básico y, tras permitir que los neuroblastos se adhirieran a una placa de cultivo celular, comenzaron a aparecer extensas redes de células neuronales con neuritas y células pigmentadas, típicas del SNC, con un aumento drástico en eficiencia y pudieron mantenerse en cultivo durante más de tres meses. Estas células neuronales derivadas de células ES humanas expresaron beta tres tubulina en comparación con la diferenciación multilínea espontánea de células sin tratamiento con ácido retinoico y coexpresaron map dos. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para generar progenitores neuronales en células neuronales de manera uniforme a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes en aproximadamente cuatro semanas, si se realiza adecuadamente.

No olvide que trabajar con células humanas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como asegurarse de que las líneas celulares estén libres de patógenos y micoplasma, antes de realizar este procedimiento.