Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de

El objetivo general de este procedimiento es extraer el ADN del parásito de la malaria y del mosquito a partir de las secciones del intestino medio y de las glándulas salivales de los especímenes de anomalías. Esto se logra primero cortando el mosquito exactamente en la articulación entre el abdomen y el tórax, separando así el intestino medio de la sección de las glándulas salivales. A continuación, cada sección se tritura por separado en agua desionizada.

Luego, la suspensión de tejido se lisa y se lava, y se recupera el pellet celular. Finalmente, el pellet celular se reconstituye y se hierve, y se extrae el ADN. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran ADN de alta calidad de mosquito y del parásito de la malaria, adecuado para usar como molde en la identificación de anomalías, especies de vectores y genotipificación de infecciones por malaria mediante PCR y digestión con enzimas de restricción específicas de alelo.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica muy sencilla frente a los métodos existentes, como la extracción orgánica y los métodos de clasificación, es que utiliza muy pocos reactivos seguros y fácilmente disponibles, así como mucho menos tiempo de procesamiento. Para comenzar a diseccionar el mosquito, colóquelo sobre un pequeño trozo de paraformo y colóquelo bajo un microscopio estereoscópico. Cúbralo con una gota de agua desionizada.

Para ablandar el tejido en tamaño, realice un corte preciso en el cadáver del mosquito exactamente en la articulación entre el tórax y el abdomen. De esta manera, se separan la cabeza y el tórax de la sección abdominal. Transfiera cada sección de mosquito diseccionada a un tubo microcentrífugo estéril limpio de 1,5 mililitros previamente etiquetado con el número de identificación del mosquito y la sección corporal; deseche la película de parafina y, utilizando una toalla Kim humedecida con alcohol al 70 %, limpie cuidadosamente la platina del microscopio antes de pasar al siguiente mosquito. Para extraer primero el ADN del mosquito, pipetee 20 microlitros de agua desionizada en el tubo de la muestra.

Y utilice la punta de pipeta para triturar la sección sumergida del mosquito hasta obtener una suspensión uniforme. Añada 100 microlitros de una solución de PBS 1X esterilizado en autoclave con 1% de saponina al homogenato de la muestra y mezcle suavemente mediante vortex. Incube la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos.

A continuación, centrifugue a 20.000 G durante dos minutos y deseche el sobrenadante. Re_suspenda el botón en 100 microlitros de PBS 1X. Luego repita la centrifugación.

Agregue 75 microlitros de agua estéril desionizada y 25 microlitros de suspensión de resina Cellex 100 al 20% peso por volumen en agua desionizada, y remueva suavemente mediante vortex para resuspender el sedimento, utilizando una aguja hipodérmica estéril de calibre 23 flameada en mechero Bunsen. Perfore un orificio en la tapa del tubo de muestra.

Hervir la suspensión de la muestra en un bloque térmico durante 10 minutos. Centrifugar a 20.000 G durante un minuto y transferir la solución de ADN a un vial de almacenamiento previamente etiquetado para su uso como molde en reacciones de PCR, con el fin de verificar la calidad del ADN extraído, amplificando una región del gen mitocondrial de la subunidad cuatro de la nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa de artrópodos, que debe producir un fragmento de 400 pares de bases. A continuación, para diferenciar entre las especies de Ananais Gambia, amplificar una región que flanquea los SNPs en la región espaciadora intergénica, que debe producir fragmentos de 390 pares de bases para Ananais Gambia Sensu Stricto y de 315 pares de bases para ananais api.

A continuación, genotipar los polimorfismos de resistencia a los fármacos antifolatos en *P. falciparum*. Realice una PCR anidada para amplificar la región que flanquea los codones de aminoácidos 16, 51, 59, 108 y 164. En el gen de la dihidrofolato reductasa de los parásitos, lleve a cabo la digestión alélica específica del amplicón para detectar la resistencia a los fármacos antifolatos.

Polimorfismos asociados. Verifique las reacciones en un gel de AROS al 2 %. Los ejemplos de resultados de ensayos PCR para el análisis de la calidad del ADN extraído de mosquitos, la identificación molecular de RABIS y la genotipificación de p. falciparum muestran que el método Kelex simplificado produce resultados similares al protocolo estándar de salting out, a pesar de requerir menos pasos y menos de una cuarta parte del tiempo, con una calidad comparable del ADN en los extractos respectivos. No es sorprendente que las tasas de positividad de las muestras respecto a anomalías, especies hermanas de Gambia, así como las tasas de infección por parásitos, no presentaran diferencias estadísticamente significativas según la prueba de chi cuadrado de McNear.

La adición de BSA a las mezclas de reacción provoca un aumento general de los resultados positivos en la PCR debido a la eliminación de inhibidores de la PCR tanto en el protocolo de extracción simplificado con kelex como en el protocolo convencional de precipitación salina. Sin embargo, este aumento no fue estadísticamente significativo, excepto en la calidad del ADN de los extractos con kelex. La digestión con enzimas de restricción específicas para alelos del amplicón de p falciparum permite la genotipificación de infecciones de malaria en el intestino medio y las glándulas salivales para alelos de resistencia a fármacos una vez dominada la técnica.

Esta técnica debería poder realizarse en aproximadamente 37 minutos si se realiza correctamente.