Una técnica simplificada para fabricar un modelo de lesión isquémica
2 de mayo de 2012
Hemos desarrollado una técnica mínimamente invasiva para crear un conejo isquémico modelo de herida del oído mediante la división de la arteria central y los nervios y el paquete vasculonervioso del cráneo. Un túnel subcutáneo y luego corta todos los tejidos subcutáneos. Este procedimiento provoca la interrupción mínima de la piel y puede usarse de manera segura en animales diabéticos.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en permitir la creación de heridas isquémicas, no solo en conejos normales, sino también en conejos con resistencia reducida, como aquellos que son ancianos o diabéticos. Todas las técnicas utilizadas actualmente para la creación de heridas isquémicas son altamente invasivas, y hasta ahora, ninguna de estas técnicas puede emplearse en animales diabéticos. Este procedimiento utiliza una cirugía mínimamente invasiva que comienza con la realización de tres pequeñas incisiones en la piel sobre los tres haces vasculares.
El siguiente paso consiste en aislar y proteger la vena central y el haz vascular coddle para reducir la circulación sanguínea hacia la oreja, pero sin eliminarla por completo. Finalmente, los vasos restantes, nervios y tejidos subcutáneos se seccionan o ligan mediante incisiones en la piel. La isquemia auricular se confirma mediante la ausencia de pulso arterial, el aspecto de la oreja, la diferencia de temperatura y la saturación subcutánea de oxígeno.
Esta cirugía mínimamente invasiva puede parecer difícil de realizar, pero en realidad es muy sencilla. La principal ventaja de esta técnica es que provoca muy poca alteración de la piel. Desde que publicamos esta técnica por primera vez en 2007, hemos recibido muchas preguntas.
Hemos simplificado aún más este procedimiento. Para facilitar su realización sin usar un microscopio, comience pesando el conejo, anestesie al conejo utilizando una mezcla de ketamina y xilacina. Monitoree los signos vitales del conejo; en la cara dorsal se pueden identificar tres haces vasculares que irrigan la oreja.
Estos son el haz central, que es el más grande y tiene colaterales que se conectan con otros vasos; el haz coddle, en el cual la arteria generalmente es muy pequeña o está ausente; y el haz craneal. En el lado ventral, la piel distal no recibe irrigación sanguínea de los vasos proximales.
En cambio, los haces vasculares en la oreja dorsal presentan numerosas ramas penetrantes a través del cartílago para proporcionar irrigación sanguínea a la piel ventral distal. En algunos conejos, también existe un vaso subcutáneo muy pequeño en el lado ventral, que irriga no más de un tercio de la piel ventral. En una incisión cutánea circunferencial abierta, esencialmente no hay sangrado proveniente de una incisión ventral.
Antes de continuar, asegúrese de que el conejo no responda a estímulos de dolor mediante una compresión del dedo del pie y el reflejo ocular; proteja los ojos del animal aplicando una pomada de lágrima artificial. Mantenga al conejo caliente durante la cirugía con una almohadilla calefactora. Luego, con una solución de Betadine y alcohol, limpie ambas orejas y la piel circundante, y coloque un campo quirúrgico sobre el conejo de modo que solo queden expuestas las dos orejas.
Una oreja quedará isquémica mientras que la otra sirve como control. Los instrumentos utilizados para la cirugía son un bisturí quirúrgico con una hoja número 15, dos pares de pinzas, una para la piel y otra para los demás tejidos blandos. Tres pinzas mosquito, uno o dos pares de tijeras microcurvas, un par de tijeras pequeñas para cortar suturas y tejidos resistentes, un portaagujas y algunas punzones de acero inoxidable.
Comience la cirugía identificando los tres pedículos vasculares según las arterias y venas. Utilizando una hoja número 15, realice cuidadosamente una incisión cutánea vertical en el pedículo vascular central.
Aislar la vena central de los tejidos circundantes y protegerla. Este paso rodea la vena central para su retracción.
Disecte el nervio central libremente. Normalmente se encuentra en el lado interno de la vena. El nervio se corta con tijeras.
Disecar la arteria central libremente. Normalmente se encuentra en el lado craneal y más profunda que la vena; ligar la arteria y dividirla. Limpiar los tejidos alrededor de la vena central sobre el cartílago del oído.
Se realiza una segunda incisión en la piel sobre el pedículo codal. Para preservar el haz, los vasos se disecan y se rodean para su protección.
Esto es especialmente útil cuando la vena es grande, como en este conejo. Haga un túnel entre esta incisión y la primera. Corte los tejidos subcutáneos sobre el cartílago.
Se realiza una tercera incisión en la piel sobre el haz craneal. Todo este haz se liga y se separa. La piel sobre el tercer haz se abre mediante un corte.
Esta vena está muy cerca de la piel, así que no corte demasiado profundamente. Luego se diseca libremente todo el haz vascular, se liga y se separa. Utilizando un bisturí y tijeras, haga un túnel subcutáneo.
Las tres incisiones interrumpen todos los tejidos subcutáneos, músculos, nervios y ramas vasculares pequeñas. Utilice disecciones adicionales afiladas y romas para limpiar la base, dejando el cartílago desnudo con un ancho de entre cinco y diez milímetros. La hemorragia puede controlarse mediante presión con gasa.
La electrocoagulación no es necesaria. La piel dentro de la oreja no se corta, ya que no tiene una gran irrigación sanguínea. El aspecto importante de este procedimiento es garantizar una disección adecuada del túnel subcutáneo protegiendo al mismo tiempo los vasos sanguíneos.
Este procedimiento no debería ser tan difícil. Después de la hemostasia, las tres incisiones en la piel se cierran con suturas de 4-0 o 5-0 y se revisan nuevamente para asegurarse de que las incisiones estén adecuadamente cerradas y de que no haya sangrado. Para pruebas de fármacos en heridas, se pueden crear cuatro heridas circulares de espesor completo en la cara ventral de cada oreja utilizando un punzón de acero inoxidable de seis milímetros.
La distancia entre las heridas es de al menos 20 a 30 milímetros. Se elimina la piel y el pericondrio dentro del punch, pero el cartílago no se daña. Después de crear las heridas en ambas orejas, cúbralas temporalmente con gasa y traslade al conejo a una sala de procedimientos para la aplicación del fármaco.
Después de limpiar las heridas de cualquier coágulo sanguíneo, aplique los fármacos de prueba y control. Las heridas se cubren con un vendaje oclusivo para prevenir la desecación. Al comparar dos fármacos, aplique cada fármaco a una herida proximal y distal.
Esto controla las diferencias en las tasas de cicatrización de heridas en la oreja distal y proximal en el período posoperatorio. La oreja isquémica generalmente se vuelve fría y cianótica, con una sensibilidad reducida en la zona distal a la incisión. Puede presentarse un edema leve durante unos días, pero desaparece espontáneamente y no se requiere tratamiento alguno.
El pulso de la arteria central está ausente. El movimiento de la oreja está reducido, pero no eliminado por completo porque algunos músculos aún están unidos a la base de la oreja. Si el túnel se realiza correctamente, se puede observar una indentación clara entre las incisiones.
Se coloca un parche de fentanilo en la piel de la espalda para aliviar posibles dolores postoperatorios. La temperatura de la piel se mide diariamente en cada oreja con un termómetro. La circulación sanguínea se mide en la oreja utilizando un medidor de tensión de oxígeno transcutáneo o un medidor de flujo láser Doppler.
Después de una semana, los puntos de las incisiones en la piel pueden retirarse desde 2007. El procedimiento se ha utilizado en más de 70 conejos. Esto incluye 23 conejos diabéticos y cuatro ancianos.
Las diferencias de temperatura entre la oreja no isquémica y la isquémica oscilaron entre uno y diez grados Celsius, con la mayoría de los conejos dentro del rango de dos a seis grados Celsius. La diferencia de temperatura fue mayor en los primeros días tras la cirugía y disminuyó gradualmente después del día 15, pero aún se mantuvo al final de un mes. Se tomaron seis muestras de tejido de cada oreja y se midieron los contenidos de fosfatos de alta energía mediante HPLC, tanto de TP como de energía total.
Las concentraciones fueron más altas en las orejas normales que en las orejas isquémicas. Los tiempos de cicatrización de heridas siempre fueron más largos en la oreja isquémica que en la oreja no isquémica en animales no diabéticos y diabéticos en 15 conejos no diabéticos. El tiempo promedio de cicatrización fue de 17,8 días en la oreja no isquémica frente a 21,8 días en la oreja isquémica.
En animales diabéticos de 10 a 12 meses, el tiempo medio de curación fue de 18,3 días en la oreja no isquémica frente a 29,1 días en la oreja isquémica. En todos los animales, incluidos los conejos diabéticos, las incisiones cutáneas sanaron normalmente sin complicaciones en los conejos. Con un tiempo diabético de 24 meses, las heridas ventrales tienen una mayor tendencia a infectarse.
Esta característica lo hace más similar a las heridas diabéticas humanas. Una muestra de histología muestra la cicatrización del túnel subcutáneo en el que el músculo está ausente y es reemplazado por tejidos fibrosos. Sin embargo, la piel está intacta.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar tratar a los animales de manera humanitaria. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora. Hemos utilizado esta técnica en más de 70 conejos, incluidos 23 conejos diabéticos, sin ninguna complicación como hemorragia o infección.
Es un procedimiento muy seguro siguiendo este protocolo. Se pueden realizar otros métodos, como isquemia adicional, daño nervioso e inoculación bacteriana, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como las relacionadas con úlceras vasculares, úlceras por presión y neuropatía diabética.
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Descripción general
Este estudio presenta una técnica mínimamente invasiva para crear un modelo de herida isquémica en la oreja de conejos, particularmente adecuado para animales diabéticos. El método implica la disección cuidadosa de los haces vasculares para reducir la circulación sanguínea mientras se minimiza la alteración de la piel.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Cicatrización de heridas
Antecedentes
- Las técnicas actuales para la creación de heridas isquémicas son altamente invasivas.
- Los métodos existentes no son adecuados para animales diabéticos.
- Los enfoques mínimamente invasivos pueden reducir las complicaciones.
- Comprender la anatomía vascular es crucial para este procedimiento.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica para crear heridas isquémicas en conejos.
- Permitir la investigación en modelos diabéticos.
- Simplificar el proceso quirúrgico para una aplicación más amplia.
Métodos Utilizados
- Se realizan tres pequeñas incisiones en la piel sobre los haces vasculares.
- Se aíslan y ligan la vena y la arteria centrales.
- Se crea un túnel subcutáneo para minimizar la alteración del tejido.
- Se realiza una prueba de detección de drogas en la herida tras la cirugía.
Resultados principales
- La técnica crea con éxito condiciones isquémicas en la oreja.
- Se logra una mínima alteración de la piel durante el procedimiento.
- El modelo es efectivo para estudiar la cicatrización de heridas en conejos diabéticos.
- La retroalimentación indica que el procedimiento es más sencillo de lo que se percibía inicialmente.
Conclusiones
- Esta técnica mínimamente invasiva es segura para modelos diabéticos.
- Permite realizar estudios controlados de heridas isquémicas.
- Mayor simplificación puede aumentar la accesibilidad para los investigadores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica aborda un vacío crítico en la investigación de heridas diabéticas al permitir la creación de modelos de heridas isquémicas en animales con resistencia fisiológica reducida, como conejos diabéticos. Facilita la desactivación mecanicista de candidatos terapéuticos al replicar el componente de vasculopatía que impide la cicatrización en heridas diabéticas humanas. El diseño de heridas apareadas, isquémicas y no isquémicas, dentro de un mismo animal mejora la confianza predictiva y reduce la variabilidad en los ensayos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas en condiciones isquémicas que imitan la fisiopatología de las heridas diabéticas humanas.
- Valor operativo: Proporciona un sistema biológicamente relevante para validar dianas implicadas en procesos de curación dependientes del sistema vascular.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que fracasan en entornos isquémicos a pesar de su eficacia en modelos no isquémicos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lechos de heridas isquémicas estandarizados y reproducibles para una evaluación consistente de compuestos entre estudios.
- Valor operativo: Minimiza la alteración del tejido y la complejidad del procedimiento, mejora el rendimiento y reduce la variabilidad entre animales.
- Preparación para ensayos: Crea cuatro heridas isquémicas y cuatro no isquémicas por animal, lo que permite controles internos y flujos de trabajo eficientes de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Modela el microambiente isquémico presente en heridas diabéticas humanas, mejorando la relevancia de los datos preclínicos de eficacia.
- Toma de Decisiones Ajustada al Riesgo: Revela respuestas diferenciales a fármacos entre heridas isquémicas y no isquémicas, informando los criterios de avance o detención.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Demuestra utilidad en animales diabéticos con duraciones de enfermedad desde 2 semanas hasta 2 años, apoyando la modelización de enfermedades crónicas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas de eficacia preclínica, especialmente para heridas en las que el deterioro vascular es un factor clave de fracaso.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías dependientes de isquemia y aclara la función del blanco en entornos de baja perfusión.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas de la cicatrización de heridas con alta reproducibilidad, permitiendo una clasificación confiable de compuestos.
- Analítica: Ofrece puntos finales medibles, como el tiempo de cicatrización, la diferencia de temperatura y los niveles de fosfatos de alta energía, para comparaciones objetivas.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante la modelización de una barrera clínica clave—la vasculopatía—en la cicatrización de heridas.
- Reutilización Empresarial: El procedimiento simplificado y robusto puede adoptarse en diversos equipos y sitios para generar modelos isquémicos de forma consistente.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al incorporar un factor patofisiológico importante—la isquemia—ausente en los modelos estándar de heridas.
- Valor operativo: Reduce las complicaciones quirúrgicas, la carga de entrenamiento y la variabilidad entre animales mediante pasos estandarizados y mínimamente invasivos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al identificar compuestos ineficaces en fases tempranas, reduciendo los fracasos en fases avanzadas debido a la resistencia isquémica no modelada.
- Impacto en la cartera: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en el desempeño en condiciones tanto isquémicas como no isquémicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección microvascular y técnicas de sutura para la ligadura precisa de haces arteriales, venosos y nerviosos.
- Depende de instrumentos quirúrgicos estériles, incluyendo bisturí #15, tijeras microquirúrgicas, pinzas mosquito y suturas para el cierre de la piel.
- Necesita un monitoreo postoperatorio estandarizado mediante sondas de temperatura, oximetría transcutánea o fluometría con láser Doppler para confirmar la isquemia.
- La adaptación entre sistemas modelo puede requerir ajustes anatómicos según la vascularización y el tamaño de la oreja.
- Limitación práctica: el efecto isquémico puede disminuir gradualmente después de aproximadamente un mes, lo que requiere una evaluación oportuna del punto final.
