De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

El objetivo general de este artículo en video es describir una técnica para someter células adherentes a condiciones de flujo laminar y evaluar la respuesta a esfuerzos cortantes de fluido bien cuantificables. Esto se logra primero ensamblando el circuito de flujo sin la cámara de flujo. El circuito incluye el pulso del reservorio, amortiguador de pulsaciones, tubos rígidos, tubos flexibles, llaves de paso de cuatro vías y adaptadores tipo lure conectados, así como un filtro de aire.

El siguiente paso consiste en llenar el circuito con el fluido deseado, como medio celular en condiciones estériles, y luego encender la bomba para llenar el amortiguador de pulso y purgar el tubo de aire. A continuación, se inserta la portaobjetos con células en la placa inferior de la cámara de flujo. El paso final del procedimiento es el ensamblaje completo del circuito de flujo con la cámara de flujo conectada en línea.

Finalmente se pueden obtener resultados que muestran la alineación de células progenitoras endoteliales marcadas con fluorescencia bajo exposición a estrés cortante del fluido a través de la cámara transparente utilizando un microscopio de fluorescencia. Para estudiar el comportamiento funcional de las células, a menudo es necesario imitar la fisiología in vivo sometiendo las células a estrés cortante del fluido. Hemos diseñado una cámara de flujo de placas paralelas y un circuito de flujo continuo, que nos permiten estudiar las células bajo condiciones de flujo y observarlas a través de la cámara transparente.

Esta técnica puede servir como una herramienta de investigación valiosa para los campos de la medicina y la ingeniería. Nuestra cámara de flujo permite la visualización intermitente o en tiempo real de células bajo flujo, utilizando un microscopio derecho o invertido. Además, el diseño del Dr. Ach Nick permite a los investigadores obtener imágenes de células sobre superficies transparentes u opacas a los rayos X, empleando lentes de microscopio estándar.

Además, puede ser una herramienta importante en la investigación farmacológica para estudiar el efecto de fármacos sobre células bajo condiciones de flujo. La visualización del montaje es fundamental, ya que varios de los pasos son difíciles de dominar únicamente mediante la lectura de un protocolo. Daré instrucciones paso a paso sobre cómo configurar la cámara de flujo y el circuito de flujo comúnmente utilizados en el laboratorio del Dr. Ock Next para armar el circuito de flujo.

Comience por sujetar un segmento de tubo rígido de 36 pulgadas a un extremo del amortiguador de pulso y al otro extremo. Conecte un segmento de tubo flexible de 18 pulgadas. Coloque un adaptador macho de acople rápido de una octava de pulgada en el extremo del tramo de tubo flexible de 18 pulgadas.

Conecte el cebo macho a un adaptador hembra de un octavo de pulgada. Fije el cebo hembro a un nuevo segmento de tubo flexible de 18 pulgadas. Taladre tres orificios en la tapa de un vaso de precipitados de vidrio de 250 mililitros.

Para ajustar el tubo, inserte un segmento de 1,5 pulgadas de tubo flexible en un orificio, como ventilación de aire. Inserte los extremos libres del tubo rígido y del tubo flexible a través de los otros dos orificios en la tapa, dentro del frasco de vidrio de 250 mililitros, que actuará como depósito.

Asegúrese de que el tubo rígido alcance el fondo del depósito. El mantenimiento de la esterilidad durante toda la configuración del circuito es crucial para el éxito de este procedimiento. Por lo tanto, todas las partes deben esterilizarse y usted debe usar guantes estériles en todo momento.

Además de las piezas ensambladas, estas piezas deben esterilizarse. Una cámara de flujo completa, tres segmentos de tubo flexible de dos pulgadas, un adaptador macho y uno hembra, un adaptador tipo lure de una octava de pulgada, cuatro tornillos planos de media pulgada, 6 5 16 pulgadas, ocho de 30 segundos. Pulgadas de pista por pulgada, tornillos de cabeza plana, un par de pinzas, un portaobjetos de vidrio y dos toallas esterilizadas por vapor.

Autoclavado a 121 grados Celsius durante 60 minutos. Coloque la cámara de flujo del circuito de flujo, cuatro cojinetes de cuatro vías, uno por uno, llave de paso y todas las piezas esterilizadas sobre este campo estéril. Mientras lleva guantes estériles, conecte los dos cojinetes de cuatro vías.

Coloque tapones en los puertos de muestra abiertos. Desconecte los adaptadores macho y hembra que unen los dos segmentos de tubo flexible del circuito de flujo e inserte las llaves de paso conectadas. Conecte el tubo flexible insertado en el depósito a una jeringa de 30 mililitros y retire el émbolo de la jeringa.

Llene el frasco con 125 mililitros de medio EPC. Vuelva a conectar el tubo blando a la llave de paso. Coloque un filtro estéril de jeringa en la válvula de aire.

Ahora transfiera el circuito de flujo a una incubadora humedecida a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono. Sujete el tubo rígido en la cabeza de la bomba peristáltica Master Flex indicada para usar con este tipo de tubo Palmer de carbón. Asegúrese de que el tubo no se superponga con las pistas de montaje de la bomba peristáltica.

Marque el tubo en el punto donde sale de la cabeza de la bomba por ambos lados con un rotulador. Después de asegurarse de que todas las llaves de paso están cerradas hacia los puertos de muestra y abiertas a lo largo del circuito de flujo, encienda la bomba. Verifique la dirección del flujo.

El PERFUSE ocho debe moverse desde el depósito de vidrio a través del tubo rígido hasta el amortiguador de pulso. Para el montaje de la cámara de flujo, use guantes estériles para conectar un segmento de tubo flexible de dos pulgadas a un adaptador hembra de un octavo de pulgada con cierre tipo bayoneta. Conecte otro segmento de tubo flexible de dos pulgadas a un adaptador macho de un octavo de pulgada con cierre tipo bayoneta.

Conecte el tubo blando de dos pulgadas con adaptador hembra tipo "lure" al puerto de entrada y el tubo blando de dos pulgadas con adaptador macho tipo "lure" al puerto de salida. Conecte llaves de paso de cuatro vías a ambos adaptadores tipo "lure". Conecte el tramo restante de tubo blando de dos pulgadas al conector del puerto lateral que sale del trampa burbujas y fije una llave de paso unidireccional utilizando pinzas estériles.

Retire el portaobjetos sembrado con células del recipiente de cultivo celular y colóquelo en el hueco de la placa inferior de la cámara de flujo. Asegúrese de colocar el portaobjetos con el lado que contiene las células hacia arriba; utilice una jeringa o pipeta para colocar 10 mililitros de medio EPC tibio sobre el portaobjetos con células. Permita que el medio cubra el portaobjetos dentro de la cámara de flujo, pero evite que el medio se derrame sobre la junta tórica (O-ring) de la placa inferior.

Coloque la placa superior de la cámara de flujo sobre la placa inferior, alineando los orificios para los tornillos. Mantenga las dos placas paralelas para no introducir burbujas de aire en la cámara al unirlas. Utilizando un destornillador automático accionado por batería, desaire el trampa de burbujas de entrada abriendo la llave de paso unidireccional conectada al puerto de la trampa de burbujas del lado de entrada.

Utilice una jeringa de 10 mililitros para enjuagar suavemente el tubo de entrada con medio EPC y luego cierre esta llave de paso y colóquele la tapa. Ahora desaire el canal de la cámara abriendo la llave de paso de cuatro vías del puerto de salida y enjuagando suavemente el medio EPC a través de la cámara de flujo. Nuevamente, utilizando una jeringa de 10 mililitros, tape todas las conexiones de la llave de paso de cuatro vías y ciérrelas.

Transfiera la cámara de flujo al incubador humedecido con el circuito de flujo ensamblado. Pausar la bomba del circuito de flujo para cerrar el circuito. Cierre las llaves en la dirección del flujo para evitar fugas.

Conecte la cámara de flujo al circuito de flujo. Una vez que la cámara de flujo haya sido conectada al circuito de flujo, abra las llaves de paso en la dirección del flujo. Reanude la bomba de flujo y asegúrese de que el PERFUSE eight fluya en la dirección correcta. Ajuste el caudal a la tensión de cizalladura deseada.

Durante el experimento de flujo, la cámara de flujo puede retirarse del circuito para observar las células mediante microscopía óptica o fluorescente. Para ello, desconecte la cámara de flujo del circuito de flujo en las conexiones entre los grifos de cierre. Para recoger el perfusado, tome ocho muestras para su análisis.

Primero, detenga la bomba y cierre la llave de paso ubicada más cerca del amortiguador de pulso. Retire su tapa protectora y colóquela boca abajo para asegurarse de que no se contamine. Introduzca una jeringa pequeña en el puerto de muestra.

Cierre la llave de paso en la dirección de la cámara de flujo, manteniendo el puerto de muestra y el circuito en dirección al amortiguador de pulso abiertos. Aspire la cantidad deseada de muestra desde el circuito, luego cierre la llave de paso hacia el puerto de muestra antes de retirar la jeringa. Almacene la muestra abundante ocho en un vial etiquetado y congele a menos 80 grados Celsius.

Cierre nuevamente el puerto de la muestra y asegúrese de que todas las llaves de paso estén abiertas antes de iniciar el flujo. Mediante este método, las células progenitoras endoteliales derivadas de sangre humana pueden sembrarse sobre portaobjetos de titanio en menos de 15 minutos y adherirse bajo fuerzas de cizallamiento fisiológicas. Como se muestra en esta figura, las CPE se extienden bajo la influencia del flujo, pasando de aproximadamente 210 micrones cuadrados inmediatamente después del siembra a unos 657 micrones cuadrados tras tres horas y cerca de 1.152 micrones cuadrados tras 48 horas de estrés cortante de fluido de 15 dinas por centímetro cuadrado.

Esta imagen de microscopio óptico ilustra la orientación aleatoria de las CEP humanas. Tras un período de asentamiento estático de seis horas después de tres horas de flujo a 100 dinas por centímetro cuadrado, las células se han extendido pero permanecen en una orientación aleatoria. Después de 48 horas de estrés por cizallamiento fluido a 100 dinas por centímetro cuadrado, las CEP se alinean y orientan en la dirección del flujo.

Aquí, las EPC se marcaron con CTO y los núcleos celulares se tiñeron con herx antes de morir tras el flujo. Para comparación, esta imagen muestra EPC porcinas sobre portaobjetos de titanio alineadas con la dirección del flujo. Después de 48 horas de flujo y una exposición al estrés cortante de 15 dines por centímetro cuadrado, los bordes celulares se tiñeron con tinción anti pcam y los núcleos con tinción de ácido nucleico citoxina.

Este método también permite obtener muestras del PERFUSE ocho en puntos de tiempo predeterminados para el análisis y/o cuantificación de metabolitos celulares secretados. Aquí se muestra un ejemplo de la producción de nitrito durante un experimento de flujo de 48 horas con EPC porcinas. Al realizar este procedimiento, es importante mantener la esterilidad en todo momento.

Además, es importante tomar las medidas necesarias para reducir el número de burbujas de aire en la cámara de flujo antes del inicio del flujo continuo, ya que estas podrían desprender las células. También recomendamos verificar cada conexión individual en la cámara de flujo y en el circuito antes de la perfusión, para evitar fugas de PERFUSE eight durante un experimento. Esta cámara está diseñada con anillos tóricos integrados que permiten el cierre completo entre las placas superior e inferior y proporcionan un sellado hermético sin necesidad de bombas de vacío.

Esta característica también garantiza una altura constante de la cámara entre experimentos y elimina la necesidad de juntas de goma o ajustes. Nuestra cámara de flujo utiliza portaobjetos de microscopio estandarizados. Por lo tanto, un gran número de células está disponible para experimentos posteriores.

Por ejemplo, el ARN y el ADN de células después del flujo se pueden evaluar para analizar la síntesis de proteínas o la expresión génica. Nuestro diseño de circuito permite la recolección y perfusión de ocho muestras para el análisis y cuantificación de metabolitos celulares, como el nitrito, un metabolito oxidativo primario del óxido nítrico, que es secretado por las células bajo estrés por cortante del fluido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo armar nuestra cámara de flujo y el circuito de flujo estéril para someter a las células adherentes a un estrés por cortante del fluido.