La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la cutícula en nematodos vivos transparentes utilizando el colorante lipofílico fluorescente rojo dye eye. Esto se logra preparando una población de nematodos para la tinción. A continuación, se añade el colorante dye eye diluido a la población y se deja incubar.

Luego, los animales se recuperan de la solución de tinción. La imagen de fluorescencia del cutículo teñido con Dai muestra detalles en la superficie, incluyendo estructuras reproductivas de los ojos de Ailey y Ann y otras características morfológicas externas. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes para visualizar el cutículo en este organismo transparente, como la imagen directa, la fluorescencia, la expresión de transgenes, la tinción con anticuerpos, la microscopía electrónica y el aglutinina de germen de trigo marcado, es que esta técnica es fácil de realizar, relativamente rápida y económica, y proporciona una resolución hermosa de las estructuras cuticulares en animales vivos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en muchos campos que utilizan el sistema modelo Caenorhabditis elegans y su cutícula, como la secreción celular y la organización de la cutícula, el desarrollo de células epidérmicas, las vías génicas heterocrónicas, la inmunidad innata, el desarrollo de rasgos morfológicos y la evolución de nematodos. El procedimiento será demostrado por Robbie Schultz, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Al trabajar con D Eye, tenga en cuenta que es sensible a la luz.

Proteja siempre el ojo D de la luz envolviéndolo en papel de aluminio. Use además guantes y una bata de laboratorio, ya que el DMF es tóxico y el DAI es un car. El cianuro Dai es muy potente.

Una dilución de trabajo de concentración estándar es de 30 microgramos por mililitro de DII en M nueve, y una sola población solo requiere 400 microlitros de la dilución de trabajo. Comience con una placa de 60 milímetros poblada con nematodos no contaminados. Lave los animales de la placa con 1,5 mililitros de Triton X 100 al 0,5 %.

En tampón M nueve, agite suavemente el líquido en movimientos circulares para desalojar todos los animales larvales y adultos, y luego transfiera el lavado a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugue inmediatamente los animales a 2000 RRP M durante 30 segundos para recogerlos en el fondo del tubo. Deseche tanto sobrenadante como sea posible sin perturbar los animales.

Tenga cuidado, no sea codicioso. Lave los animales con un mililitro de M nueve. Centrifugue y elimine el sobrenadante.

Repita el lavado. Centrifugue nuevamente y elimine el sobrenadante. A continuación, agregue 400 microlitros de Dai a 30 microgramos por mililitro en M nueve al tubo.

Vortexe brevemente el tubo para resuspender los animales. Luego, agite el tubo a 20 grados Celsius en posición horizontal durante tres a 16 horas a 350 RPM en un entorno protegido de la luz. La duración de estos últimos pasos es importante.

Primero, el Triton X debe lavarse antes de eliminar los lípidos que el dai une. Segundo, los animales deben teñirse en la solución de colorante para ojos el tiempo suficiente para permitir una tinción uniforme de la cutícula. Un poco más tarde, debe permitirse que los animales se recuperen en alimento el tiempo necesario para eliminar el colorante no unido.

Al finalizar la tinción, centrifugar los animales y eliminar la solución de colorante. Lavar los animales con un mililitro de M nueve. Para eliminar el colorante no unido, centrifugar los animales y eliminar el sobrenadante.

Re suspender los animales en 400 microlitros de tampón M nueve y verterlos sobre una porción libre de bacterias de una microplaca NGM. Sembrada con OP 50 E Coli, dejar que los animales se recuperen en la oscuridad durante al menos 30 minutos, pero no más de un día, ya que la fluorescencia del colorante se desvanece durante el tiempo de recuperación. Los animales deben arrastrarse fuera del líquido de tinción y hacia la comida.

Estos animales son más fáciles de imaginar ya que tienen menos fluorescencia de fondo procedente del colorante libre en el ojo. Comience por preparar una capa de agarosa sobre un portaobjetos para garantizar un grosor uniforme de la capa de agarosa utilizada. Dos espaciadores.

Se fabrica un espaciador superponiendo dos trozos de cinta adhesiva de laboratorio sobre un portaobjetos. Los espaciadores pueden utilizarse indefinidamente. A continuación, coloque un portaobjetos limpio longitudinalmente entre dos portaobjetos espaciadores y agregue por pipeta aproximadamente 150 microlitros de agar cuatro fundido.

En el centro del portaobjetos de vidrio limpio. Cubra rápidamente el AER fundido con otro portaobjetos colocado perpendicularmente sobre el AER y ambos espaciadores para formar una almohadilla de agar. Deslice cuidadosamente el cubreobjetos, manteniendo la almohadilla centrada en la parte superior del portaobjetos de montaje.

Ahora pipetee cinco microlitros de anestésico para nematodos sobre el portaobjetos, coloque de ocho a doce animales en el anestésico y cúbralos suavemente con una lámina de microscopio. Observe los animales utilizando un microscopio compuesto o confocal equipado con un objetivo de al menos 40 x y un filtro trissy u otro filtro compatible. El máximo de excitación fluorescente del colorante eye es de 549 nanómetros y su máximo de emisión es de 565 nanómetros.

Para animales fijados, la obtención de imágenes es la parte más desafiante de este protocolo. Mostramos cómo montar los animales para la obtención de imágenes, pero es necesario contar con la formación adecuada en el uso del microscopio compuesto o confocal que se vaya a emplear. Hemos encontrado que el uso de un objetivo con al menos 60 x de magnificación es lo mejor para resolver los detalles iluminados por el método de tinción.

Cada una de las imágenes de esta sección se tomó utilizando un objetivo de 63 x en embrión posnatal de C. elegans. La superficie de la cutícula presenta surcos circunferenciales separados anualmente y, en algunas etapas, crestas longitudinales denominadas ailey. Cada una de las imágenes de esta sección se tomó con un objetivo de 63 x en C. elegans posnatal.

La superficie de la cutícula contiene anillos anuales separados por surcos circunferenciales y, en algunas etapas, crestas longitudinales denominadas aley. Cada estadio de desarrollo presenta estructuras cuticulares con composiciones y patrones distintos, y tanto las crestas como los surcos de aley y Aly se tiñen fluorescentemente, dependiendo de la composición de la superficie.

Durante todas las etapas de larva y adulto utilizando este método de tinción por reposo, permanecen visibles hasta un día después de la recuperación. A veces se observan puntos fluorescentes de fondo, pero no de forma rutinaria. Este es el cutícula de animales adultos mutantes que presentan defectos moderados en la organización del cutícula.

Las crestas ailey son discontinuas y supernumerarias. Las crestas ailey están fusionadas y ramificadas o bifurcadas, un marcador transgénico común. Un alelo dominante de rollo seis provoca torsión de la cutícula, lo cual puede observarse en la ailey y puede hacer que los anillos presenten un patrón irregular.

Dai también tiñe otras estructuras del cutículo externo, incluyendo el vulva de la hembra adulta y la cola alzada y en abanico del macho adulto; Dai también puede resaltar defectos sutiles en la morfología externa, como esta cola bifurcada, con una tinción insuficiente. Por ejemplo, una tinción de dos horas da lugar a una coloración cuticular irregular, aunque las neuronas expuestas al ambiente pueden teñirse. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas, sin incluir la obtención de imágenes, si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo teñir Caenorhabditis elegans con el colorante DiI para la observación de estructuras morfológicas externas como el cutículo y otras estructuras externas.