La constricción crónica del nervio ciático y pruebas de hipersensibilidad dolor en ratas

El objetivo general de este procedimiento es realizar una constricción crónica, lesión del nervio ciático, un modelo comúnmente utilizado en roedores de dolor neuropático, y medir cuantitativamente los comportamientos de dolor resultantes. Esto se logra primero colocando cuatro ligaduras de sutura de tripa crómica alrededor del nervio ciático expuesto a nivel del muslo medio para crear una lesión por constricción del nervio ciático. A continuación, se monitorean los comportamientos de dolor en la pata trasera en los puntos de tiempo deseados mediante la medición cuantitativa del umbral de retirada de la pata ante un estímulo mecánico utilizando un aesthesiómetro von Frey y la latencia de retirada de la pata ante un estímulo térmico utilizando un analgesímetro plantar.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la existencia de dolor mecánico y térmico, así como hipersensibilidad de la pata trasera lesionada, mediante la medición de respuestas evocadas de retirada frente a estímulos tanto mecánicos como térmicos. Este método de lesión del nervio periférico, desarrollado inicialmente por Bene y Z, puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo del dolor crónico, como cuáles son los mecanismos periféricos y centrales mediante los cuales se genera el dolor neuropático. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del dolor neuropático, ya que este modelo proporciona la base para examinar nuevas estrategias destinadas a reducir la hipersensibilidad al dolor.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque colocar las suturas intestinales cmic alrededor del nervio estático y con una tensión adecuada para provocar una lesión nerviosa suficiente pero no excesiva es particularmente complicado. Para comenzar este procedimiento, desinfecte la superficie quirúrgica con etanol al 70 % y prepare los instrumentos estériles, gasas, grapas y torundas, que previamente han sido autoclavados. A continuación, anestesie la rata en una cámara de inducción utilizando ISO al 5 %.

Administre 2 %ISO de flor durante la cirugía a través de una máscara facial personalizada. A continuación, afeite la pata trasera izquierda de la rata y coloque al animal sobre una alfombra calefactora con regulación térmica a 37 grados Celsius. Aplique una pomada oftálmica lubricante a los ojos.

Luego, prepare el hilo de sutura de tripa crómica cortándolo en pequeños trozos de aproximadamente tres centímetros e inmersos en solución salina estéril. A continuación, esterilice el área afeitada mediante tres aplicaciones alternas de alcohol y solución de yodo. Con el animal acostado sobre su tórax, eleve su pata trasera izquierda y sostenga el fémur en un ángulo de 90 grados respecto a la columna vertebral utilizando cinta adhesiva en el pie.

Luego, realice una incisión en la piel aproximadamente de tres a cuatro milímetros por debajo del fémur. Separe la piel del músculo que rodea la incisión cortando el tejido conectivo. Utilice un par de tijeras romas para cortar el tejido conectivo entre los músculos glúteo superficial y bíceps femoral.

A continuación, utilice un retractor para ampliar el espacio entre los dos músculos y permitir una visualización clara del nervio ciático; luego, use la pinza y las tijeras microquirúrgicas para liberar suavemente aproximadamente 10 milímetros del nervio ciático del tejido conjuntivo circundante. Coloque la primera ligadura proximal a la trifurcación del nervio ciático para cada ligadura. Comience con un solo lazo suelto.

Luego, sujete los dos extremos cerca del lazo y tire hasta que el lazo quede apenas ajustado y la ligadura no se deslice a lo largo del nervio. A continuación, mantenga el lazo en su posición correcta y coloque un segundo lazo encima del primero para completar el nudo. A continuación, corte los extremos sueltos de la ligadura hasta dejarlos redondeados; la constricción de un milímetro debe ser mínima.

Repita los pasos para las tres ligaduras restantes, atando cada ligadura adicional un milímetro más proximal que la anterior. También, al final de la cirugía y con mínima constricción, use suturas para cerrar la capa muscular y grapas para fijar la piel. A continuación, use solución de yodo para esterilizar la herida.

Observe atentamente al animal durante el período de recuperación de la anestesia y permita que se recupere en una jaula separada con cama de papel plano. Antes de comenzar el experimento, manipule al animal diariamente durante varios días.

Luego, antes de la prueba conductual, habitúe a la rata en el recinto. El entorno de prueba debe mantenerse tranquilo y bien controlado, con temperatura y niveles de humedad constantes, y cada sesión de prueba debe realizarse a una hora similar del día. Para estudiar el umbral mecánico de retirada el día de la prueba, coloque a la rata en la jaula de prueba con piso de malla elevado, entre 15 y 30 minutos antes del experimento; utilice un analizador dinámico plantar von Frey y coloque la unidad estimuladora táctil con el filamento directamente debajo de la superficie plantar media de la pata trasera, y presione la tecla de inicio.

Esto eleva el filamento para estimular mecánicamente la superficie plantar de la pata trasera con una fuerza creciente. A continuación, registre el umbral mecánico de retirada de ambas patas traseras, lesionada y no lesionada. Este dispositivo registra y muestra automáticamente el máximo aplicado durante la reacción de retirada.

Repita la estimulación mecánica tres veces con un intervalo de aproximadamente cinco minutos entre los estímulos, probando las patas traseras no lesionadas en orden contrabalanceado, y luego calcule la media de los umbrales de retirada de la pata. Para estudiar la latencia térmica de retirada el día de la prueba, coloque la rata sobre el piso de vidrio. Coloque la jaula de prueba de 15 a 30 minutos antes del experimento; utilizando un instrumento térmico para analgesia plantar, posicione la fuente de infrarrojos directamente debajo de la superficie plantar media de la pata trasera y presione la tecla de inicio.

Esto expone la superficie plantar de la pata trasera a un haz de calor radiante a través de una superficie de vidrio transparente. Luego registre la latencia de retirada de ambas patas traseras, la lesionada y la no lesionada. Este dispositivo registra automáticamente el tiempo transcurrido desde el inicio del estímulo térmico hasta la retirada de la pata de la fuente de calor.

Repita la estimulación térmica al menos tres veces con un intervalo de aproximadamente cinco minutos entre los estímulos, probando las patas traseras lesionadas y no lesionadas en un orden contrabalanceado, y luego calcule la media de las latencias de retirada de la pata. Aquí se muestra el umbral de retirada mecánica en ambas patas, lesionada y no lesionada, de ratas Wistar antes y hasta 12 días después de la constricción crónica del nervio ciático. Se observa una reducción significativa en el umbral de retirada de la pata frente a estímulos mecánicos en la pata trasera ipsilateral lesionada en comparación con la pata trasera contralateral no lesionada. Se muestra aquí la latencia térmica de retirada en ambas patas, lesionada y no lesionada, antes y hasta 12 días después de la constricción crónica del nervio ciático.

De manera similar, la latencia al retiro térmico se reduce significativamente en la pata trasera ipsilateral lesionada en comparación con la pata trasera contralateral no lesionada. Una vez dominada la cirugía de CCI, puede realizarse adecuadamente en tan solo 20 minutos por animal, lo que resulta en una hipersensibilidad al dolor a largo plazo de la pata trasera. Al intentar este procedimiento, es importante recordar atar las ligaduras de forma suelta, ya que es la autoestrangulación debajo de las ligaduras tras el edema la que provoca la constricción tras su desarrollo.

Esta técnica de lesión del nervio periférico combinada con la evaluación de la hipersensibilidad al dolor mediante la onda P ofrece a los investigadores en el campo del dolor neuropático una herramienta para explorar los mecanismos subyacentes al dolor crónico provocado por lesión nerviosa.