Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster

El objetivo general de este procedimiento es medir cuantitativamente las actividades reguladoras de genes de elementos reguladores cis o CRE activos durante el desarrollo metamórfico de Drosophila melanogaster. Comience con métodos de integración sitio-específica para generar líneas de CRE incorporados transgénicamente como transgenes reporteros. Mediante el uso de un microscopio estereoscópico, obtenga especímenes transgénicos del estadio de desarrollo correcto.

Retire los especímenes del pub externo y móntelos sobre un microscopio de vidrio. Deslice para registrar el nivel y el patrón de expresión de la proteína reportera fluorescente en muestras enteras mediante análisis microscópico confocal. Finalmente, cuantifique el nivel de expresión de la proteína reportera fluorescente en las imágenes confocales registradas utilizando la herramienta de software Image J.

Estos resultados asignan un nivel de actividad reguladora génica al elemento regulador auxiliar y facilitan estudios comparativos adicionales sobre expresión génica en versiones modificadas de CRE. Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave y resulta de interés en la regulación génica y en cómo se codifica dicha regulación. El ADN resulta relevante en biología del desarrollo y evolutiva.

Este procedimiento fue desarrollado para obtener información sobre los elementos reguladores cis que funcionan durante el desarrollo metamórfico de Drosophila melanogaster. En principio, sin embargo, puede aplicarse a elementos reguladores cis que funcionen durante otras etapas del desarrollo y en otras especies de moscas de la fruta, o incluso en otros organismos modelo. Para ampliar las líneas transgénicas, prepare dos viales con varios machos y hembras alternando los días.

Transfiera las moscas de uno de los frascos a un nuevo frasco. Repita esto durante una semana. Al final de dos semanas, verifique que las moscas transgénicas abarquen desde las etapas larvarias hasta las etapas de adulto en su desarrollo.

Comience a clasificar los especímenes al final de la etapa larval de tercer estadio, cuando se haya formado el ER. Observe que el espécimen no es móvil. El ER es blanco blando y las esféricas han evitado especificar este punto temporal.

Como cero HAPF. Distinga machos de hembras por la presencia de gónadas situadas bilateralmente cerca del punto medio del cuerpo, que aparecen como círculos translúcidos para la clasificación según la longitud de la metamorfosis. En cero HAPF, transfiera los especímenes a un vial fresco utilizando un pincel humedecido.

Agregue un trozo de toalla Kim y humedézcalo con agua para evitar que los especímenes se sequen. A continuación, incube el frasco a 25 grados Celsius hasta el HAPF deseado. Alternativamente, clasifique los especímenes ordenándolos según la identificación de la presencia y posición de varios marcadores morfológicos, tal como se detalla en el texto adjunto.

Con cinta de laboratorio, adhiera un trozo de cinta adhesiva para embalar a una tabla de disección, con la superficie pegajosa orientada hacia arriba. Humedezca un pincel y aplique humedad a los especímenes tratados utilizando un pincel. Transfiera los especímenes a una toalla de papel Kimwipe.

Transfiera los especímenes a la cinta adhesiva y colóquelos con la superficie dorsal hacia arriba. Deje secar los especímenes durante 15 minutos. Abra progresivamente el ER utilizando pinzas.

Comience en el extremo anterior o anterior y continúe hacia el extremo posterior. Luego transfiera el espécimen a una gota de aceite viscoso sobre un portaobjetos para microscopio y evalúe la muestra microscópicamente para especímenes montados en fresco. Utilice el objetivo Forex o de 10 x para enfocar el espécimen.

Utilizando el software del microscopio confocal, ajuste la longitud de onda de excitación para la proteína fluorescente deseada para prevenir el fotoblanqueamiento. Comience con una intensidad láser del cinco al 10 %. Si la señal es insuficiente, aumente la intensidad según sea necesario para mejorar la relación señal-ruido. Para imágenes confocales, active los ajustes del software que promedien las mediciones de píxeles a partir de escaneos repetidos, como el promedio de Kalman, para comparaciones cuantitativas de la actividad de CRE, utilizando la sección C donde la fluorescencia aparezca más intensa.

Cambie a una tabla de búsqueda de advertencia de saturación y ajuste la ganancia y el desplazamiento de voltaje del canal a valores en los que pocos píxeles estén saturados. Si es necesario, ajuste la abertura confocal. Una vez determinados los ajustes óptimos, realice el escaneo ZS para obtener una serie de imágenes a lo largo del eje Z.

Una vez finalizada la exploración, convierta la pila de imágenes en una proyección y guarde este archivo de imagen en formato TIF. Para la comparación cuantitativa de las actividades de CRE, utilice la misma configuración del microscopio confocal para todas las muestras replicadas y las líneas de transgén del gen reportero. Para el experimento con el programa Image J, abra una imagen TIFF que se evaluará.

Haga clic en el botón de selección a mano alzada y delimite el área del espécimen donde se desee la cuantificación. Para obtener una estadística del valor de píxeles, haga clic en la pestaña analizar y luego seleccione medir. Registre el valor medio del puntaje de píxeles desde el cuadro de resultados.

También recolecte un segundo valor medio de píxeles de una región de fondo donde el CRE no está activo. Para obtener un valor medio ajustado de píxeles, continúe generando estadísticas del valor de píxeles para especímenes replicados. Luego, a partir de los valores medios ajustados de las réplicas, determine la actividad reguladora promedio para un CRE A y también calcule el error estándar de la media.

Este experimento utiliza la intensidad del fenotipo de ojo blanco rescatado para hacer homocigotos líneas transgénicas. Se utiliza un fondo genético mutante del gen blanco con una secuencia de sitio de aterrizaje A TTP para la integración específica del transgén. Los individuos transgénicos, hemizigotos y homocigotos para el vector integrado, se distinguen por la intensidad del fenotipo de color de ojo rescatado según el número de copias del gen mini blanco integrado.

Posteriormente, se establecen líneas homocigotas mediante el cruce de moscas macho y hembra con el fenotipo de color de ojos más oscuro. Se utilizan marcadores morfológicos para determinar la etapa metamórfica de Drosophila durante la metamorfosis desde la larva hasta la mosca adulta. El espécimen atraviesa una serie de morfologías estereotipadas que pueden utilizarse para determinar el sexo y aproximar la etapa de desarrollo. Aquí.

Una versión de tipo silvestre de un CRE denominado elemento dimórfico impulsa altos niveles de expresión del gen reportero EGFP en el segmento abdominal ASIC del puy hembra. Se encontró que una secuencia de 13 pares de bases dentro de este CRE es un sitio de unión para el factor de transcripción DSX, y la importancia in vivo de esta secuencia se demuestra cuantificando la actividad reguladora del CRE cuando este sitio de unión está mutado. Los análisis cuantitativos indican que la mutación de este sitio DSX redujo la actividad reguladora al 28 ± 3 % de la expresión de tipo silvestre en el contexto del sitio de inserción del transgén utilizado aquí.

Comparaciones similares evalúan actividades reguladoras para alelos de CRE intraespecíficos o entre CRE autólogos de especies separadas, por ejemplo, en comparación con los niveles de EGFP en el segmento femenino. Un seis impulsado por los CRE autólogos de la cepa D Melin gástrica Canin S para las especies D estimulantes y D willi posee actividades reguladoras iguales a 75 más o menos 4 % y cero más o menos 0 %, respectivamente. Siguiendo procedimientos como interferencia de ARN, se pueden utilizar genes de factores de transcripción para responder preguntas adicionales sobre cómo interactúan estos genes de factores de transcripción con elementos reguladores CYS.

Esto se indicaría por el aumento y disminución de la expresión de la proteína reportera fluorescente que son impulsados por elementos reguladores CIS tras su desarrollo. Este procedimiento allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regulación génica exploraran la importancia funcional que tienen los motivos de los elementos reguladores cis y las mutaciones evolutivas sobre la expresión génica.