Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

En este video, las actividades de las quinasas y fosfatasas se monitorean durante todo el ciclo celular utilizando la transferencia de energía por resonancia de Förster o FRET. Aquí, una sonda de actividad de la quinasa tipo polo uno o PLK1 tiene la proteína fluorescente cian (CFP) colocada en un extremo y la proteína fluorescente amarilla (YFP) colocada en el otro. Esta sonda se transfecta en células U2 OS.

Luego, para examinar el estado de fosforilación de LK que actúa durante la transición G2 M, las células U2 OS TRANSFECTADAS se someten a imágenes de fluorescencia con intervalos de tiempo. Cuando CFP y YFP están en proximidad cercana y se excita CFP, la energía se transfiere a YFP y puede detectarse la emisión de YFP. Sin embargo, cuando la sonda se fosforila, un cambio conformacional en la proteína separa CFP y YFP.

Ahora, cuando se excita a CFP, se detecta una fuerte emisión de CFP y solo una débil emisión de YFP; la cuantificación de la relación de la emisión de YFP tras la excitación tanto de CFP como de YFP demuestra que la actividad de PLK1 aumenta en G2 y alcanza su máximo durante la mitosis. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la filmación geométrica estándar es que se presta especial atención a que el ciclo celular no se perturbe ni por las condiciones de filmación ni por la expresión de una sonda. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del ciclo celular, como dónde y cuándo se activan quinasas o fosfatasas específicas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre enzimas reguladas por el ciclo celular, también puede aplicarse a otros sistemas donde se requieren condiciones no res, como los ensayos de proliferación celular. Para monitorear el ciclo celular humano, las células U2 OS se transfectan con una sonda de actividad de PK uno basada en fret. Mediante un método estándar de transfección con fosfato de calcio, las células se seleccionan en puromicina durante al menos siete días.

Esto enriquece la población de células que expresan la sonda y limita el número de células con niveles de expresión tóxicos o niveles de expresión que afectan gravemente el ciclo celular. Luego, se seleccionan clones estables mediante dilución limitante; la expresión de CFP y YFP se examina entonces para verificar que estén presentes en todas las células en una proporción aproximadamente igual. Si algunas células contienen solo CFP o YFP, probablemente haya ocurrido recombinación; en este caso, repita la preparación del plásmido utilizando bacterias menos propensas a la recombinación homóloga, como sure two cells, luego linealice el plásmido y repita la transfección.

Una vez que las células expresen establemente la sonda, siémbrelas en placas con fondo de vidrio número 1.5 después de que se hayan adherido y alcancen una confluencia del 30 al 50%. Cambie el medio a uno independiente de CO₂ y que no contenga rojo de fenol, y coloque las células en un microscopio de epifluorescencia motorizado con control de temperatura ajustado a 37 grados centígrados. El microscopio debe estar equipado con filtros de excitación y emisión para CFP y YFP.

Un espejo ROIC adecuado para la monitorización de CFP y YFP y un objetivo adecuado para la resolución requerida. Aquí, se utiliza un objetivo aire 20 x NA 0,75. Mediante luz transmitida, enfoque las células.

No utilice luz fluorescente en este momento, ya que inducirá una respuesta de estrés que podría alterar el ciclo celular. Para evitar la fototoxicidad, ajuste la curvatura al valor máximo disponible que permita la resolución subcelular requerida. En este experimento, debería ser posible distinguir el núcleo y el citoplasma.

Establezca un tiempo de exposición corto e inserte un filtro neutro de densidad alta. Luego, adquiera una imagen de prueba de 12 o 16 bits utilizando la excitación y emisión de YFP. Ajuste el tiempo de exposición y los filtros de densidad neutra para que la intensidad promedio en una célula sea aproximadamente igual a la intensidad del fondo más cinco veces la diferencia entre las intensidades mínima y máxima del fondo. Para verificar que las imágenes no estén saturadas, examine la intensidad de fluorescencia de la imagen de la muestra.

La intensidad máxima en la imagen debe ser inferior a la mitad del rango dinámico para permitir diferencias de intensidad cuando las células entren en mitosis. A continuación, repita este proceso utilizando filtros de excitación CFP y emisión YFP. Seleccione múltiples regiones con células transfectadas, excluyendo las regiones utilizadas para enfocar y optimizar las condiciones de exposición.

Dado que estos procedimientos podrían haber inducido una respuesta de estrés, asegúrese de que la intensidad máxima sea menos de la mitad del rango dinámico en todas las células. Instruya al software para adquirir dos imágenes cada 45 minutos utilizando excitación de YFP, emisión de YFP y excitación de CFP. Filtros de emisión de YFP.

Asimismo, configure la duración total del experimento para que exceda el tiempo del ciclo celular. Una vez que todo esté configurado, comience a adquirir imágenes; tras completar la adquisición, abra las imágenes obtenidas y supervise el tiempo del ciclo celular desde una mitosis hasta la siguiente. Para las células que expresan la sonda transfectada aquí, el tiempo del ciclo celular fue aproximadamente de 20 a 25 horas.

Compare esto con los datos de control del tipo celular utilizado. Si el tiempo del ciclo celular corresponde a los tiempos de referencia, se puede analizar el fret. Una vez que se haya verificado el cronograma, se pueden analizar las imágenes.

El análisis puede realizarse mediante la mayoría de los programas dedicados a microscopía. Aquí se utiliza el software gratuito Image J con el complemento Ratio Plus. Comience el análisis abriendo las imágenes en Image J. Si las imágenes están en formato de pila multicolor, separe los canales individuales convirtiéndolas en una pila hiperespectral seleccionando imagen.

Luego hiperpila, a continuación pila a hiperpila. Se abre la ventana de conversión a hiperpila con los ajustes mostrados; haga clic en aceptar. Ahora la imagen se mostrará con dos barras deslizantes debajo de ella.

A continuación, para separar las imágenes en pilas de canales individuales, haga clic sobre la imagen y seleccione reducir dimensionalidad de hiperpila. Se abrirá la ventana de reducción; asegúrese de que estén seleccionadas las opciones de cuadros y mantener fuente. Luego haga clic en Aceptar.

Aparecerá una nueva imagen que contiene solo un canal. Repita este proceso para obtener una nueva imagen con el segundo canal. A continuación, para aumentar la claridad visual de las imágenes finales, seleccione la pila de excitación YFP y emisión YFP.

Haga clic en Proceso y luego en Matemáticas. A continuación, seleccione Multiplicar. Cuando se abra la ventana de multiplicación, ingrese tres para multiplicar la pila de excitación y emisión de YFP por tres. Este paso es opcional y asegura que las relaciones no estén en el rango entre cero y uno.

A continuación, en la barra de herramientas de la imagen J, seleccione la herramienta de trazo libre. Luego, en la pila de excitación YFP y emisión YFP, dibuje una región de interés o ROI en un área libre de células, pero cercana a una célula que se medirá. Para agregar la ROI al administrador de ROI, haga clic en las herramientas de análisis y luego en Administrador de ROI.

Aparecerá la ventana del administrador de ROI. Haga clic en agregar para guardar las coordenadas del ROI y medir la intensidad promedio del ROI en la pila de excitación YFP y emisión YFP. Haga clic en analizar, luego seleccione medir.

Se abrirá la ventana de resultados. Seleccione la pila de emisión YFP con excitación CFP. A continuación, haga doble clic en la ROI del administrador de ROI y repita la medición.

La medición se agrega a la ventana de resultados. Desplácese a otras posiciones en la pila para repetir este proceso en múltiples puntos de tiempo. Verifique que las intensidades de fondo cercanas a la célula de interés sean similares a lo largo de toda la película comparando las mediciones en la ventana de resultados.

Para configurar las mediciones incluyendo la intensidad mínima, haga clic en analizar, luego haga clic en configurar mediciones e indique el valor mínimo y máximo de escala de grises. A continuación aparecerá una ventana que muestra las alternativas de medición. Después de ajustar el brillo y el contraste según sea necesario, dibuje una ROI que cubra la mayor parte de una célula y mida la intensidad mínima en ambas pilas.

Luego, tome las mediciones como antes, pero esta vez utilizando una célula en lugar del fondo. Utilizando los valores de las secciones de resultados, calcule la diferencia entre la intensidad mínima medida y la intensidad del fondo, y divídala por dos. Esto proporciona una estimación inicial para un valor de recorte en la relación plus seleccione complementos.

Luego, relación plus. A continuación, para la relación FRET, seleccione la pila S de excitación CFP y emisión YFP, o para la relación FRET invertida al visualizar sondas donde la eficiencia FRET disminuye tras la fosforilación. Seleccione la pila S de excitación YFP y emisión YFP para insertar las intensidades de fondo medidas y los valores de recorte.

Utilice los valores de la ventana de resultados y péguelos en la ventana de relación más. Ajuste la escala de la pila de relaciones resultante y aplique una tabla de consulta adecuada para visualizar los cambios en la relación. Se filmaron células U2 OS que expresaban una sonda basada en FRET para monitorear la actividad de PLK1 durante 60 horas, como se describe en este video.

Esta imagen muestra la entrada mitótica acumulativa de 50 células que expresan la sonda fret, incluyendo las divisiones de las células hijas. La mayoría de las células que expresan la sonda proliferan con un tiempo del ciclo celular entre 20 y 25 horas, lo que indica que las condiciones de imagen y los niveles de expresión de la sonda no afectan la duración del ciclo celular. Una representación en falso color de la razón fret invertida siguiendo una célula a través de cuatro divisiones demuestra que, aunque existe un ruido considerable, se observa una tendencia en la que la actividad de PK uno aumenta en G dos y alcanza su punto máximo durante la mitosis.

Cuando los datos brutos se filtran por la media y se presentan en forma de gráfica, es fácil estimar el tiempo entre los picos de actividad. Esta figura muestra la cuantificación de la relación FRET invertida de la célula mostrada en las imágenes anteriores, extraída de la gráfica. Puede estimarse el momento de la activación y, como se puede observar aquí, la fosforilación de la sonda se vuelve visible aproximadamente cuatro horas antes de que la fosforilación alcance su máximo en la mitosis.

Al realizar este procedimiento, es importante mantener las células en condiciones libres de estrés, lo cual se logra minimizando la exposición a la luz, así como los cambios de temperatura o pH. También es importante tener en cuenta que este método monitorea el equilibrio entre la actividad de las quinasas y las fosfatasas en una célula. Este procedimiento puede combinarse con interferencia de ARN o pantallas de inhibidores para identificar los reguladores upstream de estas quinasas y fosfatasas.