Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

Este procedimiento permite monitorear en tiempo real la muerte celular glial inducida por oligo DDR. Esto se logra primero cultivando las células, luego preparándolas para la obtención de imágenes en células vivas. El siguiente paso consiste en aplicar un tratamiento a las células y monitorear los efectos mediante microscopía de fluorescencia.

El paso final consiste en realizar el análisis de datos. En última instancia, los resultados muestran las tasas de muerte celular en una población celular tras un tratamiento o estímulo, mediante el seguimiento de la fluorescencia nuclear de un colorante fluorométrico activado por caspasa. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la tinción inmunológica es la capacidad de obtener múltiples puntos temporales simultáneamente.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como las respuestas a tratamientos farmacológicos, reactivos y diversos tratamientos. Ahora, este método puede proporcionar información sobre la muerte en cultivos celulares. También puede aplicarse a otros sistemas, como tejidos organotípicos y ex vivo, incluyendo cortes de cerebro.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades mientras se adaptan a trabajar con tejido vivo en lugar de tejido fijado. La demostración visual de esta técnica es importante, ya que hay muchos pasos para preparar muestras de células vivas en comparación con el tejido fijado. Primero descongele las células gliales inmortalizadas N 19 oligo droog congeladas en un baño de agua a 37 grados Celsius mientras las células se descongelan.

Añada siete mililitros de DMEM con alta glucosa suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a una placa de cultivo de 10 centímetros. Luego, agregue la suspensión celular gota a gota a la placa y agite suavemente la placa de Petri para distribuir las células de manera uniforme. Incube las células a 34 grados Celsius en un incubador con 5 centímetros cúbicos de dióxido de carbono durante cuatro horas tras cuatro horas.

Aspire el medio de las placas para eliminar cualquier resto de crioprotector DMSO. Reemplace con siete mililitros de medio fresco después de cuatro a siete días de crecimiento. Cuando las células hayan alcanzado una confluencia del 70 al 80 %, aspire el medio y agregue mediante pipeta un mililitro de medio gota a gota sobre la capa de células, e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Luego, recolecte las células y siembre en un plato de cultivo de tejidos de 10 centímetros con las células recolectadas a una densidad de 0,1 veces 10 a la seis células por mililitro, y coloque este plato en el incubador de cultivo de tejidos. Tras un nuevo pasaje, las células pueden sembrarse para experimentos de imágenes de células vivas. Para ello, recolecte las células como antes, luego retire 30 µL de la suspensión celular y cuente las células utilizando un hemocitómetro.

A continuación, utilice pinzas estériles para colocar cubreobjetos de vidrio sin recubrir. En los pocillos de una placa de seis pocillos, agregue células al pocillo a una densidad de 0,1 veces 10 a la seis células por mililitro. En dos mililitros de medio DMEM con alta concentración de glucosa, libre de fenol, suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina, deje crecer las células durante la noche a 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono antes de la transfección.

Al día siguiente, combine 100 microlitros de medio sin suero con 0,5 a cuatro microgramos de ADN plasmídico purificado y cuatro microlitros de FU gene hd. Vortexice suavemente la mezcla dos veces y luego deje que el ADN forme complejos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, agregue la mezcla de ADN de FU gene HD directamente a las células cultivadas.

Incline suavemente la placa para mezclar. A continuación, cultive las células durante 48 horas adicionales a 34 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono antes del tratamiento o experimentación. Primero encienda la caja de control del instrumento de células vivas LCI Cham light.

Esto debe hacerse tres horas antes de que comience el experimento para garantizar un calentamiento completo de la platina. Como mínimo, la caja de control debe encenderse una hora antes de iniciar el experimento. A continuación, trabajando en una cabina de flujo laminar, rocíe la cámara de cultivo magnética tipo LCI Cham Light y las pinzas con etanol al 70 % y déjelas secar durante cinco minutos.

Retire las células del incubador y examínelas bajo el microscopio para confirmar que se encuentran sanas. Las células deben presentarse duras y bien extendidas sobre el cubreobjetivo de vidrio, con numerosos procesos de membrana. Las células con un número reducido de extensiones procesales o con un núcleo de forma irregular probablemente estén estresadas debido a la transfección y no son adecuadas para experimentos posteriores que se realicen en la cabina de flujo laminar.

Incline la placa de seis pocillos y retire el cubreobjetos con pinzas. Coloque rápidamente el cubreobjetos con la cara de las células hacia arriba en la placa inferior de la cámara. No permita que el cubreobjetos se seque.

A continuación, fije el cuerpo magnético principal de la cámara de cultivo y añada 500 microlitros de medio procedente de la placa de seis pocillos original sobre la parte superior del cubreobjetos. Reutilizar el medio disminuye la cantidad de estrés impuesto a las células debido a cambios ambientales y también puede ser útil para evaluar factores secretados extracelulares. Una vez añadido el medio, coloque el cubrevidrio sobre la cámara de cultivo y utilice una mecha de toallitas Kim con 70 % para eliminar cualquier material residual que pudiera interferir con la microscopía en la parte inferior del cubreobjetos.

Coloque la cámara de cultivo en el incubador a 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Este paso garantizará que la cámara misma se caliente a 34 grados, lo que reduce el desplazamiento del cubreobjetos. A medida que el metal se calienta, es necesario trabajar con la iluminación ambiental de la habitación lo más baja posible durante los siguientes pasos.

Primero, Thora previamente preparó elequa de vista nuke a temperatura ambiente. Luego, retire la cámara de cultivo del incubador y colóquela rápidamente en la cámara ambiental del microscopio. Encienda el tanque de dióxido de carbono al 5 % premezclado con regulador doble.

A continuación, utilizando el objetivo de 10 aumentos, ajuste la lámpara del microscopio a aproximadamente 2,5 voltios y el tiempo de exposición a 240 milisegundos. Enfoque mediante microscopía de campo claro para visualizar las células en la pantalla del ordenador. Luego, añada una concentración de 80 milimolar de ion potasio u otro inductor de apoptosis a las células mediante el intercambio del medio con perfusión lenta y local utilizando una bomba peristáltica.

El sustrato nuke view 4 88 es estable en cultivo celular para experimentos que duran hasta 36 horas. Por lo tanto, es posible realizar experimentos durante este período de tiempo. Primero configure el microscopio para visualizar la fluorescencia de las proteínas fluorescentes roja y verde.

Luego, haga clic en el canal rojo para mostrar las células transfectadas. Seleccione y guarde aproximadamente 12 cuadros donde haya varias células transfectadas, y guarde estos puntos del escenario XY. Configure el microscopio para que capture imágenes en los canales de campo claro, rojo y verde en estos puntos del escenario guardados cada seis minutos.

Después de recopilar múltiples puntos XY a partir de experimentos duplicados o triplicados, compile los datos de experimentos separados realizados en diferentes días y realice el análisis de datos y las pruebas estadísticas según se describe en el protocolo escrito para comparar la proporción de células negativas para CASP bay respecto a células positivas para CASP bay. El sustrato Nuke view 4 88 puede indicar una tasa aumentada de apoptosis en cultivos de células gliales oligo DDR N 19. Tras un tratamiento con una concentración elevada de potasio extracelular, estas imágenes de referencia se adquirieron utilizando un objetivo de 10 veces.

Las células N 19 fueron transfectadas con RFP y se trataron ya sea con tres microlitros de nuke view, sustrato 4 88 para las células de control, o con tres microlitros de nuke view, sustrato 4 88 y 80 milimolares de potasio. Estas imágenes ilustran que el número de células apoptóticas aumenta con el tiempo, a las tres, seis y nueve horas después del tratamiento con 80 milimolares de potasio. Bajo condiciones de control, no se observaron cantidades significativas de apoptosis en comparación con los cultivos tratados con 80 milimolares de potasio. La señal verde de fondo observada en las condiciones de control indica las células que están experimentando apoptosis sin la adición de potasio extracelular.

Un curso temporal de 12 horas es adecuado para estudios que involucran lesiones neurológicas. Después de 12 horas, los cultivos tratados con potasio mostraron aproximadamente un 45 % de muerte celular. Casi ninguna de las células en el experimento control exhibe apoptosis al punto temporal de 12 horas. Aunque en otras situaciones, puede ser necesario que los experimentos se prolonguen más tiempo.

Este gráfico muestra el aumento en el número de células positivas para caspasa tres a lo largo del curso temporal del experimento de 12 horas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora y los datos pueden recolectarse durante la noche si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la consistencia entre los tratamientos siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como la tinción inmunológica, pueden utilizarse para observar otras proteínas descendentes implicadas en las vías estudiadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para su visualización, adquirir un conjunto de datos y analizar sus datos.