Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

Hola, soy Jersey. Hola, me llamo Shabi y ambos somos investigadores posdoctorales en el Imperial College de Londres, trabajando con la profesora Andrew Di Melo y el Dr. Josh Del en plataformas de microfluidos basadas en gotas. Las plataformas microfluídicas basadas en gotas son candidatas prometedoras para experimentos con mayor rendimiento, ya que pueden generarse con volúmenes muy precisos y definidos, y sus competiciones, la frecuencia de generación, puede alcanzar varios kilo por segundo.

Además, dado que la región de interés puede encapsularse en compartimentos incluso tan pequeños como unos pocos litros, se pueden eliminar tanto la interferencia cruzada como la dispersión, y los procesos analíticos pueden temporizarse con mayor precisión. En nuestro grupo, ya hemos implementado con éxito plataformas de microgotas en muchas aplicaciones. Por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, síntesis de nanopartículas y el ensayo de células a nivel molecular individual.

Las grandes cantidades de información generadas dentro de estos sistemas deben extraerse, aprovecharse y utilizarse de manera eficiente. En este sentido, el método de detección elegido debe ser adecuado, ofrecer alta sensibilidad y bajos límites de detección, ser aplicable a una variedad de especies moleculares, no ser destructivo y poder integrarse con dispositivos microfluídicos de forma sencilla. Para abordar esta necesidad, hemos desarrollado un conjunto de herramientas y protocolos experimentales que permiten la extracción de grandes cantidades de información física de entornos de pequeño volumen, y que son aplicables al análisis de una amplia gama de fenómenos físicos, químicos y biológicos.

En este protocolo, presentaremos dos métodos que se aplican a la detección de células individuales y al mapeo de procesos de mezclado en Dropbox. Los chips microfluídicos tradicionalmente se fabrican en poli (dimetilsiloxano) PDMS utilizando métodos de fotolitografía. Este proceso debe realizarse en una instalación de sala limpia para obtener canales microfluídicos Spinco, SU 8 50 sobre un sustrato de silicio horneado suavemente en una placa calefactora a 65 grados y 95 grados para evaporar el disolvente y densificar la película; tras enfriar, exponer la resistencia SU 8 a radiación UV bajo la máscara adecuada, y luego hornear nuevamente el sustrato a 65 grados y 95 grados tras enfriar.

Revelar las áreas no expuestas utilizando la solución reveladora adecuada bajo agitación. Enjuagar la oblea con disolvente EC fresco y luego secarla con gas para obtener una superficie limpia. Tratar la oblea con lavados de hexano y metanol.

Asimismo, para completar el proceso de fabricación del molde maestro, evapore un agente de fijación sobre la superficie en un desecador durante 40 minutos. Para formar sustratos microfluídicos estructurados, mezclamos S guard 1 8 4 en una proporción de 10 a 1 de resina y agente de entrecruzamiento, y extendemos esta mezcla sobre el molde. Desgasifique esta mezcla en un desecador y cure el dispositivo a 65 grados.

Corte el PDMS curado y despéllelo del molde. Cree orificios de acceso para la tubería fluida utilizando un punzón de biopsia. Cure otra capa de PDMS durante 20 minutos a 65 grados.

Coloque la capa superior preparada sobre la capa inferior y cure durante la noche a 65 grados. Pele los chips de la placa de Petri y córtelos en cubos. Una vez que los chips han sido fabricados, están listos para usarse mediante la infusión de las soluciones de interés.

Llene las jeringas con las soluciones requeridas, asegurándose de que no queden burbujas de aire en ninguna parte de los tubos. Para la generación de gotas, se utilizan dos fases. La fase dispersa acuosa contiene los reactivos de interés.

La fase oleosa actúa como la fase continua; conecte tubos con el mismo diámetro interno que las puntas de las agujas de las jeringas a un extremo de las agujas, monte las jeringas en una bomba de jeringas y defina la velocidad de flujo de infusión deseada. Para cada fase, se recomienda una relación mínima de flujo oleoso-a-cuoso de uno para evitar el mojado del PDMS por la fase acuosa, lo que provocaría una formación inestable de gotas. Conecte los otros extremos de los tubos directamente a los orificios perforados en el sustrato de PDMS.

Para soluciones más complejas, también se pueden implementar sílice, puertos capilares o conectores. Conecte el puerto de salida del chip al tubo y diríjalo hacia un colector para la recolección de desechos o para un procesamiento posterior de análisis. Una vez configurado esto, existen dos configuraciones principales de microcanales para generar gotas: el enfoque de flujo o el formato de unión en T, como resultado de las fuerzas de cizallamiento que surgen al usar estas geometrías para unir los dos fluidos admisibles y las subsiguientes inestabilidades capilares que se desarrollan en la interfaz.

Se generan espontáneamente gotas de un oh con volúmenes tan pequeños como unos pocos femtolitros. Una vez que se están generando las gotas, pueden analizarse mediante un montaje óptico. El sistema óptico se configura según el siguiente protocolo.

Utilice un microscopio confocal con capacidad de posicionamiento automático submicrométrico y un láser que funcione a una longitud de onda compatible con la absorción de los fluoróforos implicados. Para excitarlos, use un láser de pulsos que funcione a tasas de repetición de varios megahercios para la obtención de imágenes por vida media de fluorescencia. Los experimentos con flemón emplean espejos de desviación del haz y óptica para controlar tanto la altura como la dirección del haz.

Utilice un espejo dicróico para reflejar el haz láser hacia la lente del objetivo. Si se utilizan dos láseres simultáneamente, se puede instalar un espejo dicróico de banda dual. Para permitir la reflexión de los dos haces láser, utilice un objetivo microscópico de alta apertura numérica (NA) corregido para infinito, con el fin de enfocar estrechamente la luz láser dentro de un canal microfluídico.

Recopile la fluorescencia emitida por la muestra dentro del canal microfluídico, utilizando el mismo objetivo de alta apertura numérica y transmitiendo a través del mismo espejo dicróico. Elimine cualquier luz de excitación residual mediante un filtro de emisión de banda simple o dual. Enfoque la emisión de fluorescencia en un orificio de 75 micrómetros.

Utilizando una lente plano-convexa. Coloque el orificio de alfiler en el plano confocal del objetivo del microscopio. Utilice otro espejo dicróico para dividir la señal fluorescente en dos detectores.

Filtre la fluorescencia reflejada por el espejo dicromático con un filtro de emisión y enfoque con una lente plano-convexa en el primer detector. Para experimentos que involucran un fluoróforo secundario rojo, filtre la fluorescencia transmitida por el espejo dicromático con otro filtro de emisión, y luego enfoque con otra lente plano-convexa en el segundo detector. Utilice fotodiodos de avalancha para la detección de fotones de fluorescencia.

Para la adquisición de datos de fluorescencia, acople la señal electrónica proveniente del detector de fotodiodo de avalancha a un dispositivo DAQ multifunción para registro de datos que funcione en una computadora personal. Para experimentos con flema, utilice un láser de pulso y conecte los detectores a una tarjeta de conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCS PC) que funcione en una computadora separada. Esta tarjeta permite obtener los datos de vida media de fluorescencia.

Mediante una metodología TCS PC. Cada fotón fluorescente detectado se correlaciona con un pulso láser incidente y, por lo tanto, a cada fotón fluorescente emitido se le asigna un tiempo de retardo. Estos datos pueden ajustarse a una curva de decaimiento exponencial simple o múltiple para obtener una estimación de la velocidad radiativa de los fluoróforos.

Ahora sabemos que las células son altamente heterogéneas desde una perspectiva biológica, física y química. Por lo tanto, idealmente, deberíamos analizar cada célula por separado. Sin embargo, los ensayos deben realizarse con un mayor rendimiento para poder recopilar suficiente información cuantitativa y llegar a una conclusión confiable y significativa.

Aquí tenemos un ejemplo de encapsulación de células de E. coli en una sola gota, de modo que se pueda realizar. Utilice la cepa E. coli Top 10 que ha sido cultivada durante la noche. Con el fin de detectar la viabilidad de las células, use citronina y yoduro de propidio.

Ambos colorantes son colorantes intercalantes de ADN y su intensidad de fluorescencia aumenta más de 20 veces. Al unirse al ADN, citocina es un colorante fluorescente verde que es permeable a la membrana, y yoduro de propidio es un colorante fluorescente rojo que es impermeable a la membrana.

Por lo tanto, las células vivas fluorescen en verde, mientras que las células muertas exhiben emisiones tanto verdes como rojas. Aquí podemos observar la generación de gotas y la encapsulación individual de una célula mediante una unión en T. Este video fue grabado con una cámara de alta velocidad, pero las gotas pueden generarse a una velocidad de miles por segundo.

Al encapsular células, se debe asegurar de que el cultivo de células esté diluido de manera que haya menos células que gotas generadas y de que las células no sedimenten, lo cual puede ocurrir en la jeringa o en los tubos. Utilice una barra magnética de agitación dentro de la jeringa para mantener las células uniformemente distribuidas en la solución. Use tubos muy delgados, de 50 micrómetros, para conectar la jeringa al microchip.

Esto garantiza una velocidad de flujo rápida dentro del tubo y, por lo tanto, evita que las células sedimenten. A continuación se muestran ejemplos típicos de recuentos de fotones en función del tiempo para experimentos basados en células. Para mapear los procesos de mezcla dentro de las gotas.

Las gotas pueden generarse utilizando dos fluidos diferentes con distintos tiempos de vida. Dentro de una gota en movimiento, se genera un campo de flujo, que eventualmente mezcla las dos soluciones originalmente separadas para potenciar el proceso de mezcla. La simetría del campo de flujo puede alterarse utilizando canales serpenteantes.

Para analizar las gotas, enfoque el volumen de sonda óptica a la mitad de la altura de un microcanal por el cual fluyen las gotas, comenzando desde un lado del canal, y realice cada experimento a lo ancho completo del canal. En intervalos de un micrómetro. Implemente un algoritmo para diferenciar las ráfagas individuales asociadas con las gotas del fondo de ruido de la fase oleosa, y para determinar la duración de cada ráfaga.

Implemente un segundo algoritmo para extraer el tiempo de retardo y los valores de intensidad a lo largo de la longitud de cada gota en el ancho específico donde se ha realizado el experimento. Luego, utilice un algoritmo de estimador de máxima verosimilitud (MLE) para evaluar el tiempo de vida de fluorescencia de cada gota en el experimento. Promediar los valores de tiempo de vida de todas las gotas en el experimento reduce el error final del cálculo de MLE.

Cuanto más gotas se analicen, menor será el error una vez obtenida la trayectoria de vida útil. Para cada anchura, combine todas las trayectorias en un mapa 2D. Dado que cada valor de vida útil se asocia con una mezcla particular de las dos especies florales, se puede obtener así un mapa de concentración o de mezcla.

Hemos descrito la fabricación de un dispositivo microscópico y el montaje experimental junto con los protocolos asociados para la formación de microgotas, la encapsulación de regiones y la detección óptica del proceso y de las gotas. Los dos ejemplos seleccionados, la detección de células individuales en gotas y la representación de los procesos de mezclado, representan aplicaciones comunes que actualmente se están investigando mediante microfluidica de gotas.

Como ilustran los experimentos presentados, el uso de plataformas de microfluídica de gotas presenta ciertas características atractivas, como alto rendimiento debido al confinamiento perfecto y mayor reproducibilidad. La gran cantidad de información producida y la máxima velocidad a la que se genera esta información requirieron el uso de métodos de detección rápidos con la más alta resolución espacial y temporal si se desea obtener la ventaja completa de estas plataformas miniaturizadas.

En este caso, demostramos que esto es posible utilizando técnicas espectroscópicas fluoro altamente precisas.