Murino linfáticos superficiales Cirugía de los ganglios
21 de mayo de 2012
Para seguir la progresión de una respuesta inmune con el tiempo dentro del mismo ratón, los ganglios linfáticos se pueden extirpar mediante cirugía secuencial. Aquí se describe cómo esta técnica se puede realizar.
El objetivo general de este procedimiento es extirpar quirúrgicamente los ganglios linfáticos de un ratón anestesiado. Esto se logra primero localizando los ganglios linfáticos. Luego se recolectan los ganglios linfáticos y a continuación se cierra la incisión.
Finalmente, se puede obtener una suspensión de células individuales para el análisis experimental. En última instancia, las poblaciones viables de linfocitos pueden evaluarse mediante citometría de flujo. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que es necesario observar la localización y la extracción del ganglio linfático para poder dominarlas.
Después de anestesiar al ratón, aplique pomada ocular, inyecte buprenorfina y confirme la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, luego gire al ratón sobre su costado. Primero, localice el ganglio linfático braquial y luego afeite la región que será diseccionada. Después de retirar cualquier pelo suelto, aplique un desinfectante a la zona y luego realice una pequeña incisión de aproximadamente cinco milímetros en la espalda de las cuatro patas.
Utilice dos pares de fórceps para estirar la incisión hasta que se visualice el ganglio linfático braquial, que puede presentar un aspecto grisáceo o más oscuro que la grasa circundante. A continuación, pinche la fascia que cubre el ganglio linfático con un par de fórceps. Coloque el segundo par de fórceps lo más debajo posible del ganglio linfático y tire suavemente de la membrana sin romper el tejido circundante.
Luego, utilice el primer par de pinzas para romper la fascia y extraer el ganglio linfático. Si el ganglio linfático se ha obtenido con éxito, aparecerá una mancha de sangre en el lugar donde anteriormente se ubicaba el ganglio. Coloque el ganglio linfático extirpado en una solución isotónica; si se hunde, esto confirmará que el tejido obtenido es un ganglio linfático y no grasa.
A continuación, verifique que no haya pelos en la herida y cierre la incisión uniendo las dos caras internas de la piel y sujetándolas con uno o dos clips, según el tamaño de la incisión. Ahora localice un ganglio linfático inguinal y afeite la región que será disecada. Después de eliminar cualquier pelo suelto con un cepillo, aplique un desinfectante en la zona y luego realice una pequeña incisión de aproximadamente cinco milímetros por encima de la pata trasera cerca del abdomen.
Después de abrir la incisión con dos pares de fórceps como se acaba de mostrar para el nódulo linfático braquial, identifique el nódulo linfático inguinal alojado dentro del tejido adiposo circundante. Luego, retire el nódulo linfático con los dos pares de fórceps tal como se demostró anteriormente. Nuevamente, confirme la recolección exitosa del nódulo linfático observando la mancha de sangre que aparece en el lugar donde anteriormente se ubicaba el nódulo linfático, y a continuación coloque el nódulo linfático inguinal en un recipiente separado con solución isotónica.
Después de haber extraído todos los ganglios linfáticos, coloque el ratón en una jaula y agregue alimento húmedo para que pueda alimentarse fácilmente. Aproximadamente entre seis y ocho horas después de la cirugía, revise al ratón para asegurarse de que no esté experimentando dolor. Observe cuidadosamente que la postura, la marcha, la interacción con los congéneres y el aspecto del pelaje sean similares a los de un ratón sano normal.
Finalmente, disocie el ganglio linfático presionándolo contra portaobjetos esmerilados en una placa de Petri y luego transfiera el tejido a un tubo para obtener una suspensión de células individuales. Después de teñir las células con los anticuerpos contra los antígenos de superficie celular de interés, analice las células mediante citometría de flujo. Aquí se muestran gráficos de dispersión de dispersión hacia adelante y lateral para ganglios linfáticos obtenidos de animales anestesiados o sacrificados.
Los perfiles y porcentajes de células en las puertas de linfocitos viables de los dos diagramas de dispersión son idénticos. Esto demuestra que la cirugía de ganglios linfáticos es una técnica adecuada para obtener células. Una vez dominada, la cirugía de ganglios linfáticos puede realizarse en cinco a diez minutos por ratón si se lleva a cabo correctamente.
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Descripción general
Este artículo describe una técnica quirúrgica para extraer secuencialmente ganglios linfáticos de un ratón anestesiado con el fin de rastrear la respuesta inmunitaria a lo largo del tiempo. El procedimiento incluye la localización de los ganglios linfáticos, su extracción, el cierre de la incisión y, posteriormente, la obtención de una suspensión de células individuales para su análisis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Técnicas Quirúrgicas
- Análisis Experimental
Antecedentes
- Comprender las respuestas inmunitarias es fundamental en la investigación.
- Los ganglios linfáticos desempeñan un papel clave en el sistema inmunitario.
- La extracción secuencial permite el análisis temporal de las respuestas inmunitarias.
- Las técnicas visuales mejoran el aprendizaje y el dominio del procedimiento.
Objetivo del estudio
- Demostrar la extirpación quirúrgica de ganglios linfáticos en ratones.
- Facilitar el estudio de la progresión de la respuesta inmunitaria.
- Ofrecer una guía visual para investigadores.
Métodos Utilizados
- Localización de los ganglios linfáticos en un ratón anestesiado.
- Extracción quirúrgica de los ganglios linfáticos.
- Cierre de la incisión tras la cirugía.
- Preparación de una suspensión de células individuales para su análisis.
Resultados principales
- Se logró la extirpación exitosa de los ganglios linfáticos.
- Se obtuvieron poblaciones viables de linfocitos.
- Se utilizó citometría de flujo para la evaluación de los linfocitos.
- Las demostraciones visuales mejoraron la comprensión de la técnica.
Conclusiones
- La técnica permite un seguimiento eficaz de las respuestas inmunitarias.
- Las ayudas visuales son esenciales para dominar los procedimientos quirúrgicos.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para obtener mayores conocimientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cirugía secuencial de ganglios linfáticos permite el seguimiento longitudinal de las respuestas inmunitarias dentro del mismo animal, reduciendo la variabilidad experimental y apoyando la desactivación mecanicista de riesgos en la validación de dianas. Este enfoque proporciona linfocitos viables en cantidad suficiente para ensayos fenotípicos y funcionales, mejorando la confianza predictiva en estudios preclínicos de inmunología. Al facilitar experimentos de curso temporal, la técnica favorece la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el análisis temporal de la expansión de linfocitos en ganglios linfáticos.
- Valor operativo: Reduce el uso de animales y la variabilidad experimental al realizar muestreos repetidos en el mismo ratón.
- Valor científico: Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la caracterización de fenotipos de linfocitos residentes en ganglios linfáticos a lo largo del tiempo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce entre 1 y 2×10⁶ células por ganglio linfático, cantidad suficiente para la caracterización fenotípica y ensayos funcionales.
- Valor operativo: Proporciona suspensiones celulares estandarizadas y reproducibles para análisis posteriores mediante citometría de flujo.
- Valor científico: Permite la preparación de sistemas biológicos validados para la evaluación confiable de compuestos en cribados de inmunología.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante el seguimiento de la dinámica de células inmunitarias en ganglios linfáticos a lo largo del tiempo.
- Valor operativo: Facilita la alineación de biomarcadores traslacionales mediante el monitoreo inmunológico longitudinal.
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al permitir la eliminación de riesgos mecanicistas en vías inmunitarias mediadas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis hasta la validación preclínica, apoyando el seguimiento de la respuesta inmunitaria y el análisis funcional de linfocitos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el perfilado temporal de la respuesta inmunitaria.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante suspensiones reproductibles de células individuales obtenidas de ganglios linfáticos recolectados.
- Análisis: Genera poblaciones cuantitativas de linfocitos para comparaciones basadas en citometría de flujo entre diferentes puntos temporales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante un monitoreo inmunológico continuo en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad quirúrgica reutilizable para estudios inmunológicos longitudinales en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante el seguimiento longitudinal de la respuesta inmunitaria.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad en la obtención y procesamiento de linfocitos.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en los programas de inmunología.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en datos temporales de respuesta inmunitaria obtenidos mediante muestreos secuenciales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas quirúrgicas en ratones y protocolos de anestesia.
- Necesita instrumentos estériles y soluciones isotónicas para la preservación del tejido.
- Exige estandarización entre equipos para una localización y extracción consistentes de los ganglios linfáticos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes sitios de ganglios linfáticos (braquial, inguinal) y cepas de ratones.
- Está limitado por los intervalos de recuperación posoperatoria, permitiendo el muestreo cada dos días por ganglio.
