Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D

El objetivo general de este procedimiento es registrar el efecto de los campos eléctricos aplicados sobre la migración de células progenitoras neuronales en cultivos 2D y modelos 3D ex vivo. Esto se logra primero aislando y expandiendo células progenitoras neuronales in vitro. El segundo paso consiste en preparar una suspensión individual de células progenitoras neuronales.

A continuación, para la preparación del cultivo en 2D, las células progenitoras neurales se siembran en cámaras electrotácticas diseñadas a medida. Alternativamente, para la preparación del modelo tridimensional *ex vivo*, las células progenitoras neurales se marcan con los ganchos 3, 3, 3, 4, 2, y se inyectan en un modelo organotípico de corte de médula espinal. Finalmente, se aplica un campo eléctrico a las cámaras electrotácticas y se realiza una grabación con lapse de tiempo para demostrar que las células progenitoras migran hacia el cátodo del campo eléctrico tanto en entornos 2D como 3D.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método novedoso para el seguimiento en tiempo real de la migración inducida por campo eléctrico de células individuales tras su trasplante en un modelo organotípico tridimensional, que se asemeja estrechamente al entorno natural. Este método no solo puede aportar información sobre la técnica electro, migración de células neuroentales trasplantadas en cortes de médula espinal, sino que también puede aplicarse a otros sistemas como modelos de cortes cerebrales pequeños. Para comenzar este procedimiento, prepare tiras de vidrio de 22 por 11 milímetros dividiendo la autoclave de 22 por 22 milímetros.

Corte por la mitad cubreobjetos de grosor número uno utilizando un lápiz de diamante. A continuación, cree un pozo de vidrio independiente con dimensiones internas de 22 por 10 milímetros, pegando cuatro tiras de vidrio verticales de 22 por 11 milímetros entre sí mediante grasa de silicona de alto vacío; deje que el pozo se seque y endurezca completamente durante la noche. Al día siguiente, fije dos tiras de vidrio de 22 por 11 milímetros en paralelo una con otra, dejando un espacio de 10 milímetros respecto a la base de una placa de cultivo de 100 milímetros, utilizando grasa de silicona.

Luego, selle la región entre estas tiras fijando un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros con grasa de silicona. Coloque el recipiente de vidrio sobre los cubreobjetos de manera que las paredes internas creen un espacio confinado para sembrar las células. Aísle herméticamente todas las uniones con grasa de silicona.

Recubra esta región confinada secuencialmente con poli-D-lisina, seguido de laminina, como se describe en el manuscrito adjunto. En este procedimiento, obtenga los cerebros de ratones E14 a E16 y colóquelos en medio basal D-MEM-F12 frío. A continuación, retire las meninges bajo un microscopio anatómico.

A continuación, transfiera los cerebros a una placa de Petri de 35 milímetros. Utilice la pinza fina para disociar los cerebros en fragmentos de tejido. Luego, transfiéralos a un tubo centrífugo de 15 mililitros.

Se centrifugaron las muestras a 800 RPM durante tres minutos para eliminar los restos de D. A continuación, se añadió A-D-M-E-M-F 12 que contenía BFDF y DGF a las muestras. Se trituran con una pipeta de un mililitro.

Luego, obtenga la suspensión de células individuales utilizando un filtro para células. Siembre las células en los frascos a una concentración de 20.000 a 50.000 células por mililitro. A continuación, realice un cambio completo del medio cada tres días, lo que implica centrifugar las células a 1.300 RPM durante cinco minutos.

Descarte el sobrenadante, suspenda el PT en medio fresco y regrese las células al frasco cada seis días tras al menos cinco. Transfiera los NEUROESFERAS a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1.500 RPM durante cinco minutos. Descarte el sobrenadante.

Re suspender el sedimento en trips en EDTA para obtener una suspensión de células individuales. Antes de realizar el recuento celular, preparar un mililitro de suspensión que contenga 10 000 células. A continuación, eliminar la laminina del pozo de vidrio y dejar que se seque completamente.

Sustitúyalo con un mililitro de suspensión celular. A continuación, coloque la placa en el incubador a 37 grados Celsius durante un mínimo de cuatro horas para permitir la adhesión. Una vez que las células alcancen una cofluencia suficiente, retire el medio del cámara.

Retire cuidadosamente el vidrio. Luego forme un techo sobre las células sujetando cuidadosamente una cubreobjetos de vidrio autoclavada de 22 por 22 milímetros entre dos tiras de 22 por 11 milímetros con grasa de silicona. Recuerde cubrir las células con unas gotas de medio para evitar que se sequen.

Luego, forme un reservorio de medio aislado en cada extremo de la cámara creando dos barreras estancas de grasa de silicona que se extienden desde un extremo del recipiente hasta el otro. Llene la cámara con medio fresco, asegurando un flujo desde un reservorio de medio hacia el otro. Posteriormente, devuelva el recipiente al incubador durante 12 horas para permitir la recuperación celular.

En el siguiente paso, prepare una tapa para cubrir el recipiente perforando dos orificios, uno colocado sobre cada reservorio de la cámara de migración. Luego, reemplace el medio en la cámara con medio de cultivo que contenga tampón hippies 25 milimolar. A continuación, transfiera el recipiente al sistema de imagen con control de temperatura.

Establezca los parámetros experimentales para la grabación con lapse de tiempo y en múltiples posiciones. Alinee la cámara de modo que el cátodo y el ánodo queden a la izquierda y a la derecha, respectivamente, para asegurar que el vector del campo eléctrico se extienda horizontalmente, tal como se observa bajo el microscopio y se registra en el sistema de imagen. A continuación, llene dos vasos de precipitado.

Con la solución de Steinberg. Conecte un vaso separado a cada reservorio de medio utilizando los puentes de vidrio previamente preparados llenos con solución de agar al 2 % en la solución de Steinberg. Luego, coloque los electrodos de plata conectados a una fuente de alimentación de corriente continua en la solución de Steinberg.

En cada vaso de precipitados, coloque el regulador de voltaje de la fuente de alimentación en cero y enciéndala. Mida el voltaje a través de la cámara electrotáctica con un voltímetro mientras aumenta el regulador de voltaje. Luego, ajuste el voltaje según los requisitos del experimento.

Después de eso, inicie la grabación lapse. Realice un cambio de medio y reajuste el voltaje según sea necesario. Cada hora, se pueden agregar al medio fresco fármacos o agentes químicos a los depósitos según sea necesario.

Utilizando orificios adicionales perforados en la tapa de la placa de cultivo, uno situado sobre cada depósito de medio. En este paso, diseccionar las médulas espinales lumbares de ratones de dos semanas de edad. Luego, cortar las médulas espinales en secciones de 500 micrones de grosor con un cortador de tejidos machel wane bajo un microscopio anatómico.

Separar las secciones y seleccionar aquellas con estructura intacta del cordón espinal sagital axial. A continuación, colocar las secciones en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 30 microlitros de gel MA. Colocarlas lo más cerca posible del centro.

Manténgalos en una incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Para que las proteínas de matrigel se autoensamblen y produzcan una película delgada que cubra la superficie de los cortes de médula espinal, es muy importante que el matrigel se haya ensamblado completamente. Incube la placa de Petri a 37 grados Celsius durante otros 30 minutos si es necesario, luego agregue de cuatro a seis mililitros de medio D-M-E-M-F 12 que contenga tampón hepes a 25 milimolares y 15 a 20% de suero fetal de ternera.

Muy suavemente, para evitar que el medio fluya directamente sobre las rebanadas, asegúrese de que las rebanadas no estén completamente sumergidas en el medio, dejando la superficie de las berenjenas bien expuesta al aire. Cambie el medio dos veces por semana. Incube ahora la suspensión de células progenitoras neuronales en el medio con cinco micromoles de hooks.

3, 3, 3, 4, 2 durante 30 minutos. Bajo un microscopio, utilice un tubo de vidrio capilar para microinyectar dos microlitros de suspensión en el corte de médula espinal. Asegúrese lentamente de que el tubo de vidrio capilar atraviese el matrigel y alcance el interior del corte de médula espinal.

Mantenga el tubo de vidrio dentro del corte de médula espinal durante al menos 30 segundos para evitar la suspensión celular. Pase rápidamente, luego coloque la placa de Petri que contiene el corte de médula espinal en el incubador a 37 grados Celsius con 5 centímetros cúbicos de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, construya una cámara electrotáctica alrededor del corte de médula espinal que contenga células de neurogénesis etiquetadas 3 3 3 4 2 antes de aplicar un campo eléctrico que mida 500 milivoltios por milímetro.

Aquí, las células progenitoras neurales muestran una migración altamente dirigida hacia el cátodo cuando se exponen a los campos eléctricos; las líneas rojas y las flechas azules representan respectivamente las trayectorias y la dirección del movimiento celular. Y aquí se muestra la gráfica de las trayectorias de migración. Aquí se observan las células progenitoras neurales marcadas con hooks 3 3, 3, 4 2.

Fueron trasplantadas en el corte de médula espinal organotípica en el punto inicial del tratamiento con campo eléctrico. Después de que las células progenitoras neuronales migraron direccionalmente hacia el cátodo durante 2,5 horas, se invirtió la polaridad del campo eléctrico. La alteración de la polaridad del campo eléctrico desencadenó una brusca inversión del eje hacia el nuevo cátodo.

Aquí se muestra una imagen de las células progenitoras neurales trasplantadas dentro de una sección de la médula espinal. Al final de la grabación de lapso de tiempo y la reconstrucción tridimensional de las células progenitoras neurales trasplantadas dentro de la sección de la médula espinal se muestra aquí. Dominio masivo.

Esta técnica puede realizarse en dos semanas si se lleva a cabo correctamente después de su desarrollo. Esta técnica allana ahora el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploren la migración de células progenitoras neurales en sistemas de cultivo 2D y 3D en respuesta a un campo eléctrico y su aplicación.