La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

El objetivo general de este procedimiento es visualizar directamente la hipoxia tisular microregional en la corteza de ratón in vivo. Esto se logra primero preparando una ventana craneal abierta en un ratón anestesiado. A continuación, se inyecta un colorante fluorescente por vía intravenosa para marcar los vasos sanguíneos cerebrales.

Finalmente, se realiza simultáneamente la imagen de fotones de la fluorescencia intrínseca de NADH y de la microvasculatura cortical marcada con fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran hipoxia funcional en microregiones del parénquima cerebral mediante la visualización de la presencia de la forma reducida de la nicotinamida, dinucleótido de adenina. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los electrodos al estilo Clark, es que ofrece una alta resolución espacial en un amplio campo de visión y además es menos invasiva.

Este método puede realizarse en un sistema fotónico estándar aplicado con dos canales fluorescentes. Hola, soy Steve Hurst, profesor y director del departamento de microbiología e inmunología en la Universidad de Rochester. Quienes demostrarán el procedimiento hoy serán el hijo de Anita del Laboratorio Kishka, así como Oxana Paulka, profesora asistente de investigación de mi laboratorio. El Dr. Kishka, quien desarrolló la técnica de imagenología de NADH, no puede estar aquí hoy porque recientemente se trasladó a Alemania. Después de preparar el sitio quirúrgico con los instrumentos necesarios, los cuales han sido esterilizados en autoclave o desinfectados con etanol al 70%, y haber anestesiado al ratón con isoflurano al 5%, colóquelo sobre una almohadilla calefactora y coloque una máscara facial para administrar isoflurano entre 1,3 y 1,5% en aire.

Verifique el nivel de anestesia realizando una compresión del rabo. A continuación, inserte una sonda rectal y mida continuamente la temperatura corporal del animal durante todo el procedimiento. Aplique gel lagrimal artificial a los ojos del ratón para evitar que se sequen.

Luego, retire el vello de la cabeza y aplique crema depilatoria en ambos muslos durante dos minutos para eliminar el vello restante, ya que el muslo se utilizará para la oximetría. Finalmente, desinfecte el cuero cabelludo utilizando una solución de yodopovidona al 10 % y etanol al 70 %. Para realizar una ventana craneal, comience cortando cinco milímetros sobre el cráneo con tijeras.

Realice una incisión en el cuero cabelludo y avance un centímetro. Desplace la piel hacia los lados para exponer el cráneo. Para eliminar las membranas que se encuentran encima del cráneo, aplique una solución de cloruro férrico al 10%.

Limpie la solución excesiva y raspe las membranas con un ángulo de 45 grados. Paso cinco, pinzas: utilizando un microscopio de disección, identifique el área de interés. Aplique una capa delgada de pegamento rápido alrededor de los bordes de la ventana de la placa craneal.

Coloque la placa craneal de forma que el área de interés quede expuesta en la ventana y aplique una ligera presión sobre la placa craneal. Aplique una pequeña cantidad de cemento dental para polimerizar rápidamente el pegamento. Mantenga durante 10 segundos mientras el pegamento se polimeriza.

Aplique una pequeña cantidad de pegamento rápido en los bordes de la ventana para sellar la placa craneal y el cráneo. Luego, fije con un tornillo la placa craneal al soporte del animal bajo el microscopio de disección. Utilice el microtaladro con control de par ajustado a 6 000 RPM y la broca IRF 0 0 5.

Elimine todo el pegamento adicional del cráneo y de la placa craneal. Luego, configure el taladro a mil RPM e inicie la perforación del cráneo trazando un círculo dentro de la ventana de la placa craneal con un diámetro de aproximadamente cinco milímetros. Utilice movimientos suaves y barridos ligeros, como si estuviera dibujando con un lápiz muy blando.

Detenga la perforación cada 20 a 30 segundos y utilice aire comprimido para eliminar el polvo óseo. A medida que avanza la perforación, se forma un surco alrededor del cráneo intacto en el centro. Tenga cuidado de no perforar el cráneo delgado, pero asegúrese de que este surco tenga un grosor uniforme.

Además, tenga especial cuidado alrededor de los vasos sanguíneos grandes. No deben verse comprometidos y, si es posible, ni siquiera deben tocarse. Con una punta de una pinza, levante el hueso en el centro de la ventana y aplique una gota de líquido cefalorraquídeo artificial sobre la ventana. Utilizando la esquina de una toalla Kim, limpie suavemente el líquido cefalorraquídeo artificial con un ángulo de 45 grados.

Número cinco, pinzas. Localice una región de duramadre dañada a lo largo del borde de la ventana y levántela para retirarla. Si ocurre sangrado, aplique una gota de LCR artificial y espere de dos a tres minutos para que el sangrado menor cese.

A continuación, prepare 10 mililitros de aero de baja fusión al 0,07 % disuelto en líquido cefalorraquídeo artificial. Eleve el aero fundido a la temperatura corporal. Retire el exceso de líquido cefalorraquídeo artificial de la superficie del cerebro.

Vierta el aerosol en la ventana y cúbralo con una lámina de vidrio. Luego presione suavemente el vidrio para establecer contacto entre este y la placa de la base y espere de 10 a 20 segundos hasta que el aerosol se solidifique. Con pinzas y papel absorbente, retire el exceso de aerosol del recubrimiento de vidrio.

Coloque una pequeña cantidad de pegamento rápido alrededor del vidrio para pegarlo a la placa craneal. Luego, aplique una pequeña cantidad de cemento dental para solidificar el pegamento antes de inyectar en la vena femoral. Gire parcialmente al animal para exponer la cara interna del muslo izquierdo.

Use cinta adhesiva para inmovilizar al animal. En esta posición, aplique un antiséptico tópico y luego etanol al cien por ciento sobre la piel. A continuación, realice una incisión a lo largo del muslo medial desde la rodilla hasta la sínfisis púbica.

Si es necesario, separen los tejidos blandos mediante disección romo. Llenen una jeringa de un mililitro con 130 microlitros de Texas red. Adjunten una nueva aguja de calibre 30 y dóblenla cuidadosamente en un ángulo de 30 grados, manteniendo la bisel hacia arriba.

Llene la jeringa con Solución de Texas Red bajo un microscopio de disección, inserte la aguja en la vena femoral e inyecte cien microlitros de Texas Red. Retire la aguja y presione suavemente la vena con gasa para detener la hemorragia. Cierre la piel utilizando sutura de cuatro oh para el monitoreo continuo de la saturación de oxígeno en sangre.

Coloque la sonda del oxímetro en el muslo derecho del que se había eliminado previamente el vello. Para comenzar la adquisición de imágenes, transfiera el ratón preparado quirúrgicamente a la platina del microscopio. Tome una imagen inicial del sitio de la ventana craneal utilizando iluminación de campo brillante con un aumento de cuatro x como mapa de referencia para la registración con mayor aumento y fotones.

Aumente el zoom en el área de interés utilizando un aumento de 10 x. Seleccione un área de interés en las capas corticales. Uno o dos comienzan a registrar la serie temporal.

Recomendamos utilizar un promedio de tres a cinco cuadros para aumentar la calidad de la imagen. A continuación, induzca hipoxemia agregando 50% de nitrógeno al aire que respira el animal. Esto reducirá el nivel de oxígeno al 10%. Verifique la hipoxemia monitoreando los datos del oxímetro.

Continúe registrando la serie temporal durante la hipoxemia durante aproximadamente 30 segundos y después de que se restablezca el nivel normal de oxígeno. Recopile datos para el cálculo de la distribución de oxígeno mediante la detección, medición y cuantificación del área de hipoxia y los cilindros de tejido oxigenado alrededor de los vasos sanguíneos. Para determinar el radio R del cilindro de tejido croak, mida la distancia entre el centro del vaso sanguíneo y el límite en el que se detecta una fluorescencia alta de NADH.

Consulte el protocolo escrito para los métodos de procesamiento de datos. Esta figura muestra imágenes simultáneas de NADH y geografía obtenidas mediante video durante hipoxemia transitoria; la concentración de oxígeno inspirado se redujo del 21 % al 10 % durante un período de tres minutos. Este nivel de hipoxemia inducida experimentalmente es suficiente para provocar hipoxia severa en la corteza cerebral.

La hipoxia provocó un aumento en la fluorescencia de NADH, mostrada inicialmente en verde en las áreas más alejadas del suministro sanguíneo arterial. Observe los límites tisulares nítidos de NADH, que representan los límites tisulares observables de la difusión de oxígeno desde la microcirculación cortical mostrada en rojo. Aquí se presenta una imagen simultánea de los microvasos del cortex marcados fluorescentemente en rojo y la fluorescencia intrínseca de NADH del parénquima gris del cortex en verde; la distribución de intensidad de fluorescencia de NADH es binaria.

Existen áreas con fluorescencia de NADH uniformemente baja y áreas con fluorescencia de NADH uniformemente alta. Las líneas amarillas representan los límites tisulares entre las áreas con fluorescencia baja y alta de NADH. Estos límites tisulares exhiben una relación espacial con los microvasos cercanos.

Esta relación está determinada por la difusión de oxígeno desde los microvasos hacia el tejido. En algunos casos, la naturaleza cilíndrica o el cilindro de tejido CRO de estos límites tisulares puede reconocerse directamente, como indican las líneas azules. Aquí, el límite del tejido tiene forma circular con un vaso sanguíneo central concéntrico una vez dominado.

Esta técnica puede realizarse en 1,5 horas si se lleva a cabo adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar pegar el cubreobjetos a la placa metálica para evitar el movimiento vertical de la superficie cortical debido al edema. Tras este procedimiento, se pueden realizar análisis adicionales, como mediciones de hiperemia funcional con el objetivo de abordar otras preguntas, tales como la relación entre la hipoxia tisular y el acoplamiento cerebrovascular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la hipoxia tisular microregional en la corteza de ratón.