Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el efecto de la carga mecánica sobre la escisión proteolítica de proteínas individuales de manera altamente paralela y rentable. En esta demostración, en una primera etapa se examina la escisión del colágeno por la metaloproteasa matricial uno; los fragmentos de colágeno se fijan al cubreobjetos de vidrio de una celda de flujo, seguido por la unión de microesferas magnéticas de tamaño micrométrico a las moléculas individuales de colágeno. El segundo paso consiste en montar la celda de flujo en el aparato de pinzas magnéticas y verificar que las microesferas adheridas de forma no específica hayan sido eliminadas de la superficie del cubreobjetos.

A continuación, se añade la proteasa a las celdas de flujo. El paso final consiste en determinar la velocidad de proteólisis mediante el seguimiento en tiempo real de la disociación de los microesferas. Al medir las tasas de disociación de las microesferas a diferentes concentraciones de proteasa y fuerzas, es posible obtener parámetros cinéticos zoologicos estándar utilizando cantidades mínimas de sustrato y proteasa.

Además, esta técnica proporciona información única sobre el efecto de la fuerza mecánica en la velocidad de la proteólisis y en los cambios estructurales de la proteína sustrato que acompañan al corte. La principal ventaja de esta técnica en comparación con otros métodos como los trazos ópticos T y la microscopía de fuerza atómica es que esta técnica es de alto rendimiento y rentable. Aunque este método puede ofrecer información sobre la fuerza efectiva en el corte proteolítico de proteínas individuales, los instrumentos y técnicas pueden aplicarse a una amplia gama de problemas biofísicos, incluido el efecto de la fuerza sobre el plegamiento y la conformación de proteínas.

Comience la preparación de la celda de flujo limpiando las laminillas mediante sonicación. Añada las laminillas a un recipiente de vidrio pequeño que pueda contenerlas y que quepa en el sonicador. Llene el recipiente con isopropanol y sométalo a sonicación en un baño sonicador durante 20 minutos, luego deseche el isopropanol y enjuague las laminillas con abundante agua desionizada.

Llene el recipiente con agua y someta a ultrasonido durante 20 minutos. Después de la sonicación, seque las laminillas con un flujo de aire filtrado libre de polvo. Inspeccione las laminillas y utilice únicamente aquellas que estén libres de manchas.

Caliente suavemente las laminillas con la llama durante unos segundos para limpiarlas del polvo y la humedad residual, pasándolas por una llama de gas producida por un mechero Bunsen, teniendo cuidado de no deformar la laminilla debido al exceso de calor. Este paso elimina los contaminantes superficiales residuales.

A continuación, utilice cinta adhesiva transparente de doble cara para unir los dos cubreobjetos. Primero, corte la cinta en un trozo de aproximadamente tres centímetros de longitud y 0,3 centímetros de ancho, y colóquela sobre un cubreobjeto de 22 por 40 milímetros, dejando un canal de 1,6 centímetros en el centro. Utilice la punta de una pipeta para presionar suavemente el cubreobjeto y asegurarse de que la cinta se haya adherido correctamente.

El aparato de pinzas magnéticas fue construido por este laboratorio utilizando un soporte en forma de L de aluminio con un orificio de un milímetro de diámetro, montado sobre un traductor vertical en Z para modular la altura de las pinzas. Dos imanes permanentes de tierras raras se fijaron al soporte a ambos lados del orificio para crear el gradiente de campo magnético. La calibración adecuada de la trampa magnética es esencial para este procedimiento.

Para garantizar el éxito, utilizamos dos métodos diferentes, como se describe en esta sección. Para calibrar la trampa magnética, utilice ADN previamente preparado del fago Lambda marcado en sus extremos cinco prima y tres prima con biotina y digoxigenina, tal como se detalla en el protocolo escrito. Para fijar el ADN a la celda de flujo, primero llene la celda de flujo con solución de anticuerpo antidual y permita que el anticuerpo se adhiera a la superficie de vidrio durante 15 minutos.

A continuación, pase el flujo de la celda para evitar la adhesión no específica del ADN añadiendo una solución de albúmina sérica bovina (BSA) a la celda de flujo. Tenga en cuenta que para este paso de pasivación y todos los pasos posteriores, el volumen del reactivo añadido a la celda de flujo debe ser al menos el doble del volumen de la celda de flujo, que en esta demostración es de 75 microlitros; incube la celda de flujo a temperatura ambiente durante 45 minutos.

Después de repetir este paso, agregue 50 picomolares de ADN lambda funcionalizado y permita que se adhiera al cubreobjetos durante 15 minutos; luego, elimine el exceso de ADN con un lavado de XPBS. Finalmente, agregue perlas superparamagnéticas recubiertas con estreptavidina y permita que se adhieran al ADN inmovilizado durante 15 minutos. En esta demostración, se utilizan perlas de 2,8 micrómetros.

Lave los excesos de perlas con un XPBS. A continuación, realice la calibración de los pinzas magnéticas moviendo los imanes permanentes a una posición alejada de la superficie de la muestra. Luego coloque la celda de flujo preparada en el microscopio.

Coloque los imanes permanentes en posición sobre la celda de flujo. Elija el plano focal de las perlas funcionalizadas con ADN Lambda enfocando las perlas alejadas de ambas superficies de vidrio. El plano focal correcto es aquel en el que las perlas deseadas tienen un centro brillante.

Grabe un video del movimiento de las perlas en el que las frecuencias superen los 80 hercios durante 500 cuadros. Acerque el imán a la superficie de la muestra y registre un video del movimiento de las perlas en cada posición. Para distancias superiores a cinco milímetros, muévase en incrementos de un milímetro; para distancias entre uno y cinco milímetros, hágalo también en incrementos de un milímetro.

Mueva en incrementos de 0,5 milímetros para distancias menores a un milímetro, muévase en incrementos de 0,25 milímetros. Para cada conjunto de datos, rastree el centro de las perlas utilizando un ajuste gaussiano 2D. Calcule la fuerza mediante fluctuaciones brownianas, como se describe en el procedimiento escrito. Confirme la precisión de las fuerzas verificando el cálculo de la fuerza mediante un ajuste espectral de potencia de Lian.

Para hallar la frecuencia de desprendimiento, puede determinarse la relación entre la fuerza aplicada y la frecuencia de desprendimiento en el texto anterior a la fijación del péptido de colágeno en las celdas de flujo, expresar y purificar las proteínas del péptido de colágeno y de la MMP-1. Comience añadiendo la solución de anticuerpo anti-MIC a la celda de flujo e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el anticuerpo anti-MIC se fije a la superficie de la celda de flujo. Bloquee la celda de flujo para prevenir la fijación no específica de proteínas usando BSA al cinco miligramos por mililitro. Añada 150 picomolares de péptido de colágeno y permita que se fije al anticuerpo mediante la etiqueta MTTAG durante 45 minutos.

Lave el exceso de colágeno utilizando tampón PBS antes de agregar las microesferas de 2,8 micrómetros a la celda de flujo. Deben separarse de la solución de microesferas recubiertas con strep divid mediante imanes potentes y luego resuspenderse en PBS. Este proceso debe repetirse tres veces.

Este paso es esencial para lograr que las microesferas de 2,8 micrómetros se unan al péptido de colágeno inmovilizado en la superficie. A continuación, agregue microesferas superparamagnéticas recubiertas con estreptavidina y permita que se adhieran a las moléculas de colágeno durante 45 minutos. Una vez que la celda de flujo esté ensamblada con el péptido de colágeno y las microesferas magnéticas, obtenga imágenes de la celda de flujo en la trampa magnética.

Bajo una fuerza baja, una subpoblación de las perlas a veces es débil, adherida a la superficie de manera no específica. La aplicación de una fuerza moderada asegura que estas perlas sean liberadas. Añada la enzima activada a la celda de flujo.

En este caso, la MMP uno se preactivó mediante la adición de 3,5 milimolares de PMA y se incubó a 37 grados Celsius durante tres horas. Tan pronto como se reintroduce una cámara de flujo en el aparato de pinzas magnéticas, registre un video que abarque varios campos de visión, obteniendo típicamente varios cientos de microesferas unidas. Esta medición corresponde a tiempo igual a cero.

Repita el mismo proceso de grabación de varios campos de visión en intervalos de tiempo regulares hasta que todas las perlas se desprendan o no se observe más proteólisis. Las pinzas magnéticas fueron calibradas para perlas de un micrómetro y 2,8 micrómetros. Utilizando tanto la magnitud de las fluctuaciones brownianas observadas como el cálculo de la frecuencia de corte a diferentes posiciones del imán en los experimentos de proteólisis forzada, se puede graficar el número normalizado de perlas restantes en función del tiempo para determinar la velocidad de proteólisis.

Y este proceso puede repetirse con diferentes concentraciones de enzima y fuerzas. Las tasas de proteólisis dependen de la fuerza aplicada. Las tasas de proteólisis se determinaron a un picoNewton, 6,2 picoNewtons y 13 picoNewtons.

La fracción de microesferas no protegidas, que persiste durante más de 15 minutos, permanece aproximadamente constante en 0,25 en diferentes experimentos. En nuestro caso, el ensayo nos permitió medir la eficiencia catalítica de la MMP-1 en función de la fuerza aplicada. Al analizar los datos, descubrimos que la hélice triple del colágeno debe desenrollarse localmente antes de la proteólisis.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco a seis horas si se realiza correctamente. Es importante recordar que se requieren al menos de 30 a 50 perlas por campo de visión para obtener una buena significancia estadística de sus datos. No olvide que el A PMA puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, batas de laboratorio y mascarilla facial, al realizar este experimento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el efecto de la fuerza sobre la escisión proteolítica de proteínas individuales utilizando pinzas magnéticas. Las pinzas magnéticas son una excelente herramienta para comprender experimentos biofísicos de molécula individual. Esta técnica puede extenderse a otras combinaciones de proteasa y sustrato.

Además, se pueden utilizar técnicas similares para comprender la dinámica estructural de proteínas, así como para estudiar otras proteínas que se unen a o modifican el ARN y/o el ADN.