Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

El objetivo general de este vídeo es demostrar cómo medir la actividad de la red en cortes cerebrales corticales en desarrollo utilizando un indicador fluorescente sensible al calcio. Los cortes cerebrales DY se obtienen de la corteza enteral en desarrollo de un ratón joven. Tanto las neuronas como los astrocitos se cargan con marcadores dependientes del calcio.

Los cambios en la fluorescencia de los colorantes dependientes del calcio reflejan cambios en la actividad celular. Las células no neuronales, incluidas los astrocitos, la microglía y las células endoteliales, pueden teñirse utilizando colorantes marcadores específicos. La actividad de la red cortical se registra mediante imágenes de múltiples fotones con lapso de tiempo, y las células se detectan dentro de la red mediante la creación de una pila tridimensional de imágenes a través de la región de interés.

Los cambios en la fluorescencia celular a través de múltiples células pueden analizarse entonces para determinar la actividad de la red cortical en desarrollo. Un patrón característico de actividad en el sistema nervioso en desarrollo es la actividad espontánea sincronizada de la red. Se ha observado actividad sincronizada en muchas regiones neuronales en desarrollo diferentes, incluyendo preparaciones del cortex espinal intacto y cultivos neuronales disociados durante períodos de actividad espontánea, en los que las neuronas, despolarizadas para disparar, generan potenciales de acción individuales o ráfagas que activan muchos canales iónicos, incluyendo canales de calcio activados por voltaje, lo que conduce a la entrada de calcio.

Se ha medido una actividad altamente sincronizada en redes locales mediante electrodos de campo o matrices de múltiples electrodos. Estos permiten altas tasas de muestreo temporal, pero ofrecen una resolución espacial menor debido a la lectura integrada de la actividad celular. La resolución a nivel de célula individual de la actividad neuronal es posible mediante la técnica de registro con microelectrodo de parche en neuronas individuales para medir las tasas de disparo.

Sin embargo, la capacidad de realizar mediciones a partir de una red está limitada al número de neuronas que se pueden registrar simultáneamente, y normalmente solo es de una o dos neuronas. El uso de colorantes fluorescentes indicadores dependientes del calcio ha permitido medir la actividad sincronizada a través de una red de células. Esta técnica ofrece tanto una alta resolución espacial como un muestreo temporal suficiente para registrar la actividad espontánea de la red en desarrollo.

Los indicadores fluorescentes sensibles al calcio, como el éster URA 2:00 AM, contienen grupos ácido carboxílico que pueden unirse a los iones de calcio. Estos colorantes fluorescentes se activan mediante longitudes de onda específicas de luz, ya sea usando microscopía de un fotón o de dos fotones. El número de fotones emitidos por el colorante se altera transitoriamente al unirse al calcio.

Este cambio en el número de fotones o en la fluorescencia se informa como la señal delta FF y corresponde a un cambio en el nivel de calcio dentro de la neurona. La medición de los cambios en indicadores sensibles al calcio es una medida útil para evaluar los patrones de actividad de la red en células en desarrollo. Hola, soy Rianna Morty, y mi nombre es Julie Abbots.

Somos del Departamento de Neurofisiología Interpretativa y la universidad de Ámsterdam. Hemos estado utilizando la imagen de calcio para estudiar la actividad funcional en tejidos en desarrollo en la corteza del ratón, mediante indicadores sensibles al calcio en imágenes multifocales. El objetivo de este breve video es demostrar cómo estos métodos pueden utilizarse para medir patrones de actividad espontánea y evocada en redes en desarrollo en el sistema nervioso.

Extraiga rápidamente el cerebro del cráneo de un ratón joven para reducir el daño a la circuitería neuronal. Diseque el cerebro en solución fría con hielo. La solución para cortes contiene cloruro de colina en lugar del sodio comúnmente utilizado en A TSF para grabaciones neuronales.

En estos experimentos, estamos elaborando cortes cerebrales del cortex enteral del cerebro en desarrollo del ratón. Coloque un trozo de papel filtro encima de una placa de petri y humedézcalo con unos pocos mililitros de A TSF. Transfiera el cerebro al trozo de papel filtro.

Corte por la mitad los hemisferios utilizando una cuchilla de borde simple. Separe los dos hemisferios. Coloque uno de ellos de regreso en la solución de corte fría junto con el hemisferio restante.

Retire el cerebelo con la hoja de afeitar. Gire un hemisferio sobre su línea media y realice un corte de aproximadamente un milímetro desde la superficie dorsal con un ligero ángulo de la hoja hacia el extremo rostral. Gire el cerebro al otro lado sobre.

Su superficie recién cortada utilizando un bastoncillo de algodón y una espátula metálica. Transfiera el cerebro al bloque metálico de corte. Empuje suavemente el cerebro fuera de la espátula con un bastoncillo de algodón hacia la superficie adhesiva.

Se cortan secciones de cerebro de 300 micrómetros para tejido joven; las velocidades de corte y la frecuencia de la hoja son típicamente más bajas que las utilizadas para tejido más maduro. Una vez cortadas, transfiera cada sección utilizando una pipeta de vidrio; las secciones se transfieren a la cámara de almacenamiento, que contiene A CSF oxigenado a temperatura ambiente. El A CSF contiene una proporción mayor de magnesio respecto al calcio que la solución de A CSF.

Se utilizan para registrar cortes que se dejan durante una hora para recuperarse. Para cargar las células con un indicador dependiente del calcio o un marcador específico de células, es necesario transferir los cortes a una cámara para el procedimiento de tinción. Aunque existen cámaras comerciales disponibles, se puede ensamblar fácilmente una a partir de equipo de laboratorio estándar con muy bajo costo.

Para elaborar una cámara de tinción, necesitará el siguiente equipo básico de laboratorio: dos placas de Petri de plástico, una jeringa de 10 mililitros, un tramo de tubo de silicona, un inserto para cultivo celular con una membrana semipermeable, pegamento epoxi, tres conectores pequeños para tubos y una aguja fina. Tome la placa de Petri grande y haga un pequeño orificio con una varilla calentada a través de la pared lateral. Tome la placa de Petri pequeña y haga un orificio de diámetro similar, lo suficientemente grande para que pase el tubo de silicona.

Pase un tramo de tubo de silicona a través del orificio y forme un lazo dentro del recipiente pequeño. Utilice pegamento instantáneo para sellar el extremo abierto del tubo. A continuación, pegue el resto del tubo a la pared interna del recipiente pequeño de Petri.

Coloque la placa de Petri pequeña en el centro de la grande y péguela en su lugar. Tome el extremo restante del tubo de silicona y páselo a través del pequeño orificio en la pared lateral de la placa de Petri. Tome una aguja fina y haga pequeños orificios en el tubo de silicona dentro de la placa de Petri.

Realice los orificios a intervalos equidistantes para lograr una fusión de gasper uniforme. Tome un pocillo de cultivo celular con una membrana semipermeable utilizando un escalpelo calentado. Corte el centímetro superior del pocillo para dejar un recipiente poco profundo que sostenga las secciones durante la incubación.

Coloque el recipiente bajo en el centro del recipiente pequeño rodeado por el tubo de silicona porosa. Haga un orificio de aproximadamente medio a un centímetro de diámetro en la tapa del recipiente grande. Tome una jeringa de plástico de 10 mililitros utilizando un escalpelo calentado.

Realice un corte en ángulo para eliminar el extremo de la jeringa. Aplique pegamento instantáneo sobre la superficie cortada del tubo de la jeringa. Colóquelo directamente sobre el orificio en la tapa de la placa de Petri grande.

Coloque un conector de tubo en el extremo de la punta de la jeringa. Coloque el recipiente poco profundo en el centro del plato de Petri pequeño, asegurándose de que el tubo de gas poroso esté colocado alrededor del recipiente. Luego, este tubo se conecta a una fuente de gas carbógeno para oxigenar las secciones.

Durante la incubación, coloque la tapa del recipiente grande, que también está conectada directamente al suministro de gas mediante la punta de la jeringa. Esto proporcionará un flujo de carbón y gas sobre las secciones durante la incubación para evitar el blanqueo del colorante. Todos los procedimientos se realizan con la menor cantidad de luz posible, y tanto el colorante como las secciones se mantienen en la oscuridad.

Llene la cámara de tinción con aproximadamente un mililitro y medio de A TSF proveniente del portaobjetos para secciones. Coloque la cámara de interfaz en su interior y llénela con otro mililitro de A TSF. Es importante mantener un buen suministro de oxígeno para conservar el tejido sano y lograr una buena carga de la sección.

La tinción ocurre a aproximadamente 35 grados C para facilitar la absorción del colorante en las neuronas mientras la cámara de tinción se está calentando. Prepare el colorante indicador para fura 2:00 AM éster. Añada nueve microlitros de DMSO con un microlitro de ácido onico a un vial de 50 microgramos.

DMSO y ácido onícico. Actúan como agentes permeabilizantes para permitir que el colorante sea absorbido a través de la membrana lipídica. Vortexee el vial durante 15 minutos para asegurar que el colorante se disuelva completamente.

Para la tinción, transfiera cada corte a la interfase. Insértelo en la cámara de tinción. Aplique el colorante directamente sobre la región de interés por encima de los cortes y cierre la tapa de la cámara de tinción.

Deje que los cortes se incuben en la oscuridad durante 20 a 40 minutos, dependiendo de la edad del maus utilizado. Después de la incubación, transfiera los cortes nuevamente al portaportaobjetos para eliminar cualquier exceso residual de colorante. Los protocolos de tinción para la imagen de calcio también se pueden adaptar para tejido más viejo.

Esto requiere un paso adicional de preincubación. Transfiera las secciones antiguas a un recipiente poco profundo para preincubación que contenga tres mililitros de LCR y ocho microlitros de solución crema four al 0,5 %. Caliente a 35 grados C durante tres minutos. Luego, transfiera las secciones a la interfase, insértelas en la cámara de tinción y siga los procedimientos de tinción habituales.

También es posible teñir estos cortes para células no neuronales, específicamente astrocitos, microglía y células endoteliales. Se puede utilizar ruminante de azufre 1 0 1 para teñir astrocitos por dominio de azufre. Prepare una solución de 10 micromolar y pipetee el colorante púrpura sobre la región de interés en los cortes.

Dejar incubar durante un período de 15 minutos. Transferir las secciones de vuelta a la cámara de almacenamiento para eliminar cualquier exceso de colorante. El conjugado FSE de lectina de tomate puede teñir microglía y células endoteliales.

Para la lectina de tomate, prepare una solución de 20 microgramos por mililitro. Aplique el colorante sobre la región de interés en los cortes. Deje los cortes en incubación durante un período de 45 minutos.

Luego, transfiera nuevamente las secciones a la cámara de mantenimiento. Durante la adquisición de imágenes, las secciones deben permanecer estables bajo el microscopio. Por lo general, se coloca una horquilla metálica para sujetar el tejido, sin embargo, esto puede distorsionar de manera desigual la superficie de la sección, lo que da como resultado un campo de visión limitado en foco que debe evitarse durante la imagenología.

Estos cortes se adhieren a la cámara de registro utilizando solución de POLYETHALINE o PEI. El PEI es un polímero utilizado para mejorar la adhesión de las células a una superficie durante al menos una hora. Antes de colocar los cortes en las cámaras de registro, llene estas cámaras con unos pocos mililitros de solución de PEI para cubrir el fondo de la cámara.

En primer lugar, enjuague el PEI de la cámara con agua destilada, seguido de una solución de CSF trans. Transfiera una sección al cámaro de registro y elimine el exceso de solución de CSF. Coloque la sección en el centro de la cámara utilizando un pincel fino.

Elimine todo el LCR adicional utilizando pequeños trozos de papel de filtro absorbente. Tenga cuidado para asegurarse de que la sección no tenga LCR alrededor de sus bordes. Finalmente, añada suavemente medio mililitro de LCR sobre la sección sin desprenderla de la cámara.

Coloque las cámaras en un recipiente de interfaz grande y oxigenado, y déjelas durante una hora más en la oscuridad. Los cambios en los colorantes indicadores sensibles al calcio se pueden registrar mediante microscopía de un fotón o de dos fotones. Utilizamos un láser de titanio-sapera acoplado a un microscopio Olympus para permitir la obtención de imágenes de dos fotones en nuestras redes neuronales.

Además, utilizamos un sistema de visión L Vision biotech con cámara EM CCD hammer MATSU para aumentar las tasas de escaneo de cuadros. Coloque la cámara para cortes bajo el microscopio con un flujo estable de A-T-S-F-A-T-S-F oxigenado que contenga 1,6 milimolares de calcio y 1,5 milimolares. El magnesio se calienta a aproximadamente 30 grados C en el montaje utilizando luz blanca.

Localice la región de interés en el corte y enfoque la superficie. Apague las luces y cierre la puerta del gabinete de grabación. Para reducir los niveles de luz de fondo.

Hay disponibles muchos paquetes de software comerciales u abiertos diferentes para registrar y analizar imágenes. En nuestro laboratorio, utilizamos el software inspector para la adquisición de Lavis Biotech. Para comenzar la adquisición de imágenes, seleccione el modo de cámara CCD para la detección. Establezca la longitud de onda relevante para su indicador.

Para fira 2:00 AM Ester, configure la excitación a 820 nanómetros en el software del microscopio trim. Seleccione el modo de escaneo 64 B. Elija el tamaño óptimo del campo de visión y la resolución de píxeles para su región de interés.

Seleccione una frecuencia de cuadros adecuada y el giro de píxeles si es necesario para su muestreo de imágenes. Abra el obturador del láser para estar listo para la adquisición continua de imágenes. Utilizando el modo de adquisición continua.

Ajuste la ganancia y la intensidad del láser, y enfoque la red neuronal que desea imaginar. Detenga el escaneo. Seleccione la configuración de lapso de tiempo para la frecuencia de cuadros y la duración de la secuencia.

Después de la adquisición de imágenes con lapso de tiempo, realice una serie de imágenes en Z que marque 20 micrómetros por encima y 20 micrómetros por debajo en pasos de un micrómetro. Esta serie en Z se utiliza para la detección de células durante el análisis. Exporte los archivos grabados como una serie de imágenes TIFF.

Para concluir, hemos mostrado el uso de indicadores de calcio para medir la actividad espontánea sincrónica de la red en la corteza en desarrollo. Se pueden encontrar más detalles sobre la metodología y los reactivos en las hojas de datos que acompañan esta película, a fin de que puedan implementar la técnica en su propio laboratorio.