Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de ¹³ C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

El objetivo de este protocolo es estudiar el metabolismo bacteriano mediante análisis de metabolismo asistido por carbono 13. Para comenzar, los microorganismos se cultivan en presencia de sustratos de carbono marcados, los cuales se incorporan a las proteínas microbianas. Luego, los microorganismos se recolectan y se extraen los aminoácidos, que posteriormente se hidrolizan y se derivatizan.

Las muestras se aplican a un cromatógrafo de gases y espectrómetro de masas, o GCMS. Al rastrear las trayectorias de transición de átomos entre metabolitos en la red bioquímica, pueden determinarse las vías metabólicas funcionales utilizadas por el microbio. Soy Bert Burla.

El método que presentamos aquí puede utilizarse como un complemento a la transcriptómica y la proteómica para determinar las vías metabólicas en microorganismos. Hemos utilizado esta técnica para investigar microorganismos fotosintéticos, como las cianobacterias, en cuanto a la utilización de carbono mixótrofa o heterótrofa. En este video, utilizaremos ANOTHE 5 1 1 42 como cepa modelo para demostrar el uso de sustratos de carbono marcados en el descubrimiento de nuevas funciones enzimáticas.

El procedimiento será demostrado por mí mismo, Li Yu y Chu Yang Fang. Comience este procedimiento cultivando bacterias de *Cyanas thesi* en un medio no marcado. Cuando las bacterias alcancen la fase de crecimiento logarítmico media, inocule el 3 % en volumen en el medio marcado con carbono 13.

Luego, para evitar la introducción de carbono no marcado del subcultivo inicial de inóculo en el mismo medio marcado durante la fase de crecimiento logarítmico media. Cuando las bacterias Cy Thesei marcadas con carbono 13 alcancen la fase de crecimiento logarítmico media, recoger 10 mililitros mediante centrifugación. ReSuspender el precipitado en 1,5 mililitros de ácido clorhídrico seis molar y transferirlo a un vial de cromatografía de gases (GC) de vidrio transparente con tapón roscado.

Cierre los viales y colóquelos en un horno a 100 grados Celsius durante 24 horas para hidrolizar las proteínas de la biomasa en aminoácidos. La hidrólisis de los pellet de biomasa produce 16 de los 20 aminoácidos comunes tras la hidrólisis; transfiera la solución de aminoácidos a tubos microcentrífugos de dos mililitros y luego centrifugue a 20.000 Gs durante cinco minutos. Tras la hidrólisis, transfiera la solución de aminoácidos a tubos microcentrífugos de dos mililitros y luego centrifugue a 20.000 Gs durante cinco minutos para depositar las partículas sólidas.

Después de la centrifugación, transfiera los sobrenadantes a nuevos viales de GC para eliminar las partículas sólidas en la solución de hidrólisis, de modo que no ingresen a la columna de GC. A continuación, los aminoácidos se derivatizan para hacerlos volátiles y permitir su separación mediante cromatografía de gases; disuelva las muestras secas con 150 microlitros de tetrahidrofurano, THF, y 150 microlitros de N-terc-butil-dimetilsililamina y metil trifluoro.

Incubar todos los muestras con el reactivo de derivatización de acetamida T-B-D-M-S en un horno entre 65 y 80 grados Celsius durante una hora. Vortexar las muestras ocasionalmente para asegurarse de que los metabolitos en el vial estén disueltos. Centrifugar las muestras a 20.000 ×g durante 10 minutos y luego transferir el sobrenadante a nuevos viales de GC.

El sobrenadante debe ser una solución amarillenta clara. Las temperaturas de CG son las siguientes: mantener a 150 grados Celsius durante dos minutos. Aumentar a tres grados Celsius por minuto hasta 280 grados Celsius.

Aumente 20 grados Celsius por minuto hasta 300 grados Celsius, y luego mantenga durante cinco minutos. A continuación, para una columna de CG de 30 metros, ajuste el retardo del disolvente a aproximadamente cinco minutos y el rango de la relación masa a carga entre 60 y 500. Analice las muestras mediante CG-EM utilizando un volumen de inyección con una relación de división de uno a cinco o uno a 10 de un microlitro y gas portador helio de 1,2 mililitros por minuto siguiendo el análisis.

Analice los datos de GC-EM utilizando Microsoft Excel. En esta figura se ilustran el tiempo de retención en cromatografía de gases y los picos únicos de relación masa/carga para cada aminoácido. Los aminoácidos derivados generalmente se dividen claramente mediante espectrometría de masas en dos fragmentos cargados: el fragmento M menos 57, que contiene todo el aminoácido, y el fragmento M menos 159, que carece del grupo carboxilo alfa del aminoácido, en leucina e isoleucina.

El pico M menos 57 se superponía con otros fragmentos de picos de masa. Se puede utilizar N menos 15 para analizar la marcación completa de aminoácidos. Además, el grupo F 3 0 2 se detecta frecuentemente en la mayoría de los aminoácidos y contiene únicamente el primer grupo carboxilo alfa y los segundos carbonos del esqueleto del aminoácido.

Sin embargo, debido a que este pico de Ms. suele tener altas relaciones de ruido respecto a la señal, no se recomienda utilizar F 3 0 2 para analizar cuantitativamente los flujos metabólicos. La derivatización de aminoácidos o metabolitos centrales introduce cantidades significativas de isótopos naturalmente marcados, incluyendo carbono 13, oxígeno 18, silicio 29 y silicio 30. El ruido de medición proveniente de los isótopos naturales en la masa bruta o en el espectro isotópico puede corregirse mediante el uso de software publicado.

Los datos finales de marcado isotópico se reportan como fracciones de masa. Por ejemplo, M cero, M1, M dos, M tres y M cuatro, que representan fragmentos que contienen de cero a cuatro átomos de carbono marcados con carbono 13 en la ciana. Estos 5 1 1 2 no contienen la enzima treonina amonialiasa, que cataliza la conversión de treonina a 2-ceto butirato en la vía típica de síntesis de isle.

Por lo tanto, para resolver la vía del isle en este organismo, se cultivó Cyana THESEI 5 1 1 42 en medio ASP dos con glicerol 54 milimolar y se analizó mediante GCMS como se describe en este video y se muestra aquí. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utiliza glicerol marcado en la posición secundaria como fuente principal de carbono, y observamos que la treonina y la alanina, cuyo precursor es el piruvato, tienen un carbono marcado, mientras que la ISO leucina estuvo marcada con tres carbonos. Por consiguiente, la síntesis en Cyana, estas 5 1 1 4 2 no puede derivarse de la ruta de la treonina empleada por la mayoría de los organismos. Por otro lado, la leucina y la ISO leucina presentan patrones de marcado idénticos basados en el fragmento M menos 15 y el fragmento M menos 1 59.

Por ejemplo, el isótopo o los datos del nitrógeno-15 provenientes de aminoácidos NO FRAGMENTADOS mostraron un etiquetado idéntico para la leucina y la isoleucina. Por lo tanto, la leucina y la isoleucina deben sintetizarse a partir de los mismos precursores, piruvato y acetil-CoA. Esta observación es coherente con la transición del carbono marcado en la vía del citramalato para la síntesis de isoleucina.

Este método puede utilizarse para investigar el metabolismo de una amplia diversidad de microbios, y una vez dominado, puede realizarse de principio a fin en aproximadamente una semana.