Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

El objetivo general del siguiente experimento consiste en medir cuantitativamente la migración celular en tiempo real mediante microscopía de lapso de tiempo en video. Esto se logra primero recubriendo una placa de cultivo de seis pocillos con colágeno y luego sembrando escasamente las células de interés sobre la placa recubierta. Como segundo paso, se crea una herida en la placa utilizando la punta de una pipeta, asegurando un espacio suficiente para la migración.

A continuación, se configura el microscopio y se capturan imágenes a intervalos regulares utilizando un sistema de control de temperatura para permitir el monitoreo continuo de las células migratorias en tiempo real. Finalmente, se utiliza el protocolo de seguimiento de partículas para evaluar las diferencias en la velocidad promedio y el desplazamiento total de las células de prueba y las células de control. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el ensayo de migración en cámara de evitación es que no se basa en mediciones cuantitativas de migración en puntos finales.

En cambio, permite el monitoreo y el cálculo continuo de diferentes parámetros. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como por ejemplo cómo afectan genes o fármacos específicos la migración de células tumorales. Dos días antes del procedimiento, agregue 1,5 mililitros de colágeno diluido en medio opti a cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos, y luego incube la placa durante la noche a cuatro grados Celsius un día antes del procedimiento.

Re-suspender las células de interés en dos mililitros de DMEM más FBS por pocillo y transferir las células a cada pocillo de la placa recubierta con ENC de colágeno, incubando las células durante la noche a 37 grados Celsius. El día del procedimiento, utilizar la punta de una pipeta para crear una herida en las células cultivadas durante la noche y lavar cada pocillo con PBS para eliminar cualquier material residual formado como resultado de la herida.

Añada DMEM más SFB a los pocillos enjuagados y luego revise bajo el microscopio para confirmar que se ha creado un espacio limpio de herida. Después de encender la cámara del microscopio y el aparato de imagenología en tiempo real de células vivas, coloque la placa sobre la platina del microscopio. Cubra la placa con la nueva cámara de control ambiental para células vivas y ajuste el termostato a 37 grados Celsius y el dióxido de carbono a 5 %. Ahora abra el software de libro de diapositivas en la barra de menú.

Seleccione el control de enfoque haciendo clic en el botón con la F dentro de un círculo. En el cuadro del objetivo, utilice la ventana desplegable para definir el objetivo. En el cuadro del juego de filtros, seleccione los ajustes para dirigir la trayectoria de la luz hacia la pieza I. Seleccione el filtro adecuado para la iluminación de campo claro y luego haga clic en abrir campo claro.

Para abrir el obturador de campo claro. Ahora seleccione el filtro de campo claro en la torreta y observe la muestra a través del ocular para encontrar los campos adecuados y enfocar la muestra. Luego mueva la torreta de filtros para cambiar la trayectoria de la luz hacia la cámara. Para la captura de imágenes en el software del libro de diapositivas, haga clic en el control de enfoque, seleccione XY para elegir diferentes posiciones a través del ocular y luego haga clic en establecer punto para fijar cada ubicación.

Para la captura de imágenes, ajuste manualmente el enfoque de la imagen de la cámara que se visualiza en la pantalla y luego utilice las herramientas de la ventana de controles de enfoque para ajustar la posición Z de la platina. Para obtener los mejores resultados, enfoque en protrusiones celulares planas cercanas al contacto con la placa para facilitar el enfoque. Utilice el control deslizante para ajustar los tiempos de exposición a un rango adecuado para el enfoque.

Si se han seleccionado múltiples posiciones XY, ajuste el enfoque para cada posición individual seleccionando el control de enfoque. Luego xy, a continuación visite el punto. En el libro de diapositivas, seleccione el icono de cámara de la barra de menú, seleccione el tipo de captura y luego lapse de tiempo para seleccionar la duración del experimento.

En el menú desplegable, escriba el retraso deseado entre el inicio de un punto temporal y el inicio del siguiente. En los campos de intervalo, el tercer campo se calculará automáticamente a partir de los valores introducidos manualmente. En la captura múltiple XY, seleccione la lista de múltiples puntos para experimentos con más de una posición XY.

Finalmente, asigne un nombre al archivo para guardarlo, vaya al control de captura y seleccione avanzado, luego spool. A continuación, capture en la memoria y guarde en el archivo spool después de cada punto temporal. Comience haciendo clic en imagen.

En la barra de menú del libro de diapositivas, seleccione importar en el menú desplegable y luego haga clic en carrete del libro de diapositivas. Seleccione los archivos de libro de diapositivas deseados generados a partir del experimento de migración para diversos campos y puntos de tiempo. Abra el primer archivo, luego seleccione máscara en la barra de menú y elija el protocolo de seguimiento de partículas en el menú desplegable.

Bajo el menú de seguimiento de partículas, elija el protocolo de seguimiento manual de partículas. Aparecerá una ventana con los puntos de tiempo inicial y final. Para analizar la migración aleatoria, seleccione máscara y luego el protocolo de seguimiento de partículas. Nuevamente, para determinar las coordenadas del centro del objeto, seleccione centro del área.

Luego haga clic en rastrear y continúe. Ahora elija las estadísticas deseadas para cada trayectoria, como el desplazamiento y la velocidad promedio. Como se muestra aquí, haga clic en calcular para ver las estadísticas.

Un ejemplo de análisis de migración aleatoria cuantificado en términos de velocidad se muestra en este recuadro. En el gráfico de bigotes, en este experimento, hubo un aumento en la velocidad promedio en células M-D-A-M-B 2 31 con un gen supresor tumoral silenciado. En comparación con las células M-D-A-M-B 2 31 de control aquí mostradas, la migración aleatoria de las células de la primera figura fue analizada en términos de desplazamiento celular.

Nuevamente, el grupo con inhibición génica total del gen supresor de tumores mostró un desplazamiento celular aumentado en comparación con las células M-D-A-M-B 2 31 de control. Las células en este control de microscopía de video con lapso de tiempo, células MDA MB 2 31, fueron sembradas sobre colágeno durante la noche. Luego, las imágenes se tomaron a intervalos de una hora durante un total de 18 horas durante la migración aleatoria.

Observe cómo las células se desplazan desde sus posiciones originales con el tiempo. En este video, se registró y analizó la migración de células de prueba M-D-A-M-B 2 31 tras su siembra durante la noche sobre colágeno. Tenga en cuenta que las células de prueba son más migratorias en comparación con las células de control del video anterior.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la invasión celular y dynas para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cuáles son los roles de las células en la metástasis del cáncer tras su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la migración celular utilizando líneas celulares cancerosas aisladas.