Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Hola. En este video presentamos un experimento completo de seguimiento cuántico individual. Un algoritmo dedicado ha sido concebido íntegramente en colaboración con expertos en imagen ISIS. Durante este video, utilizaremos el receptor del factor de crecimiento epidérmico como modelo para describir el método de esta técnica.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico es una proteína transmembrana. Este receptor se marcará utilizando un anticuerpo monoclonal, que se reduce para conservar únicamente el fragmento A a B. El fragmento A a B se biotinila y, posteriormente, se une a la estreptavidina del punto cuántico, de modo que el sistema completo reconocerá con precisión el receptor de EGF.

Nuestro objetivo es proporcionar una visión integral de la dinámica de los receptores de superficie celular. De hecho, las trayectorias moleculares pueden desviarse de la difusión browniana al estar confinadas dentro de nano dominios. Por ejemplo, esto podría ser la señal de una interacción subyacente con, por ejemplo, proteínas de señalización u andamios moleculares.

Nos proponemos describir exhaustivamente tales eventos mediante su localización espacial en la célula, lo que requiere trabajar con alta resolución temporal SPECT junto con una densidad de marcado elevada. Por ello, denominamos a este enfoque trazado múltiple de objetivos. El primer paso del experimento es la preparación de la muestra.

Trabajamos con células vivas con o sin antibióticos. Aquí utilizamos siete células, que expresan endógenamente receptores de EGF. Después de separar la célula, necesitamos confirmar con precisión para tener el mismo número de células en cada pocillo del laboratorio.

Un número preciso de células es muy importante para aumentar la previsibilidad del número de puntos cuánticos por célula. Después de dispensar la célula en el pocillo H, es necesario incubar la placa durante 24 horas a 37 grados con 7% de CO2. El siguiente paso es la preparación de los puntos cuánticos conjugados con anticuerpos. Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes pequeñas.

Estas partículas tienen un interés muy grande aquí porque son muy brillantes y estables en comparación con las sondas fluorescentes clásicas y la señal. La relación señal-ruido es muy importante para este tipo de experimento. En este caso, utilizamos medio completo para saturar los grupos reactivos alrededor de los puntos cuánticos y prevenir la agregación.

Después de eso, tuvimos los puntos cuánticos en la proteína bioTE eluida o en los anticuerpos de interés en una proporción uno a uno, con el fin de obtener estadísticamente más puntos cuánticos monovalentes. En este experimento, utilizamos un fragmento F(ab')₂ contra el receptor de EGF producido en el laboratorio a partir de anticuerpos monoclonales y que están marcados con biotina. Durante la incubación de aproximadamente 15 minutos, puede mantenerse el control frente a la agregación y asegurar la homogeneidad utilizando un agitador a 1.200 rotaciones por minuto y 25 grados.

Cuando la mezcla esté lista, puede añadirla a sus células. Retire el medio del pocillo muy suavemente para evitar la desprendimiento celular en el técnico de laboratorio y añada la cantidad necesaria de mezcla para su experimento. En este caso, añadiremos 100 microlitros de mezcla por pocillo.

Después de añadir la mezcla, puede incubar sus células durante 15 minutos. En este caso, a 37 grados con un 7 % de CO₂. Tras esta incubación, podría observar un gran número de puntos dobles frecuentes en suspensión en el medio.

Estos puntos cuánticos deben eliminarse antes de la obtención de imágenes. Debido al ruido que introducimos, es por eso que necesitamos lavar cada uno, bueno, varias veces en este caso, cinco veces para que se limpien adecuadamente.

Utilice un medio de imagen sin autofluorescencia. Aquí utilizamos tampón HBSS con aps. Ahora sus células están listas.

Es momento de dirigirse al montaje para la adquisición. El montaje consta de cuatro partes principales: un microscopio invertido, una cámara con sensibilidad al ojo, una lámpara de mercurio potente y un incubador para mantener las células a 37 grados. La luz de la lámpara de mercurio pasa a través de una fibra y de una rueda de filtros antes de iluminar la muestra.

La fluorescencia del ejemplo se filtra y recoge mediante una cámara E-M-C-C-D situada a la izquierda. Actualmente utilizamos objetivos de aceite con apertura numérica de 1,3 y 1,49. El paso central de este experimento es la adquisición en sí misma.

Una vez que las células están enfocadas, observamos una célula representativa con una etiqueta intensa. En el caso de los puntos cuánticos, primero adquirimos una única imagen en luz blanca transmitida, que puede utilizarse posteriormente para verificar el aspecto celular y el límite especial de los podios LA. A continuación, adquirimos un video típicamente a una velocidad de 36 milisegundos, la velocidad más rápida permitida en el cuadro completo.

Utilizamos un CCD con multiplicación electrónica para alcanzar la sensibilidad a nivel de molécula individual con una relación señal-ruido suficiente, al menos por encima de 20 decibelios. Típicamente alrededor de 25 decibelios, generalmente adquirimos 300 fotogramas. Para evaluar un conjunto de datos determinado, solo necesita proporcionar la ruta al directorio que contiene los archivos de video.

Luego de escribir el comando, el texto se reconecta en MetLab o en el comando MTT 23 I, que primero muestra una interfaz gráfica con una lista. Todos los parámetros utilizados iniciarán el análisis completamente automatizado. El análisis principal de MTT se realiza en cada cuadro, invocando tres tareas principales: primero, la detección en cada píxel de la presencia o ausencia de una deuda cuántica del objetivo.

Luego, para cada detección, la estimación de los parámetros relevantes del objetivo, como su posición en píxeles, intensidad de la señal, y así sucesivamente. Por último, la reconexión de los nuevos objetivos con las trazas ya construidas a partir de los cuadros anteriores para cada píxel.

Considerando una subregión local, comparamos dos hipótesis de presencia: la de solo ruido o la de una señal. Con la función de dispersión puntual, ModuLite tiene un pico agudo. Utilizamos un umbral que garantiza una tasa suficientemente baja de falsas alarmas, con menos de una detección espuria por cuadro para cada objetivo detectado.

A continuación, realizamos un ajuste cuadrático mínimo de nutrientes fantasma para estimar la posición, anchura y altura del Goshen detectado. Esto proporciona notablemente la posición precisa de la célula espic del colorante, típicamente con una exactitud de entre 10 y 20 nanómetros para relaciones señal-ruido habituales; en picos de alta densidad, estos a menudo pueden estar demasiado próximos y los picos más intensos pueden dificultar la detección de los más débiles. Para abordar esto, desinflamos los picos detectados a partir de la imagen inicial.

Nuevamente, la detección en el residuo puede volver a desviar típicamente el 10 % de los picos. Alcanzar una detección casi exhaustiva es muy útil para una reconexión precisa. Luego, el conjunto de nuevos objetivos se asocia con el conjunto de trazas anteriores para esta pupila.

Con el fin de asignar cada traza a un objetivo si es posible, y para manejar posibles intermitencias, utilizamos toda la información estadística disponible obtenida en el paso de detección. Por lo tanto, los objetivos no se asignan simplemente a la traza más cercana. En caso de conflictos, cuando las trazas puedan cruzarse, lo que significa que sus respectivas regiones relevantes de búsqueda se solapan, consideraremos el valor estadístico de la intensidad, velocidad, anchura y parpadeo tanto para las trazas como para los objetivos.

Esto proporciona la puntuación de reconexión estadísticamente óptima. La estrategia permite evitar, cuando sea posible, sesgar la reconexión hacia los vecinos más cercanos, es decir, el movimiento más lento. A continuación, utilizamos una función para evaluar el posible confinamiento transitorio dentro de las trayectorias.

Esta función está inversamente relacionada con la difusión local, según lo establecido por Sexton Simpson y colaboradores. La aplicación de un umbral permite definir episodios confinados o no. Al iterar este proceso en todas las trazas, finalmente podemos mapear la dinámica de la membrana en términos de confinamiento transitorio y evidencia de desaceleración, lo cual puede representarse.

Alternativamente, utilizando los valores binarios o discretos de este índice de confinamiento, por defecto, MTT realizará automáticamente esas tareas, guardando para cada video los parámetros fila de cada pico en un archivo eski, y para investigaciones avanzadas posteriores. Resultados típicos, como el mapa de trazas sobre cada célula y los histogramas de distribución para parámetros de interés, intensidades de pico, relación señal-ruido, valores deficientes locales, y otros, pueden adaptarse fácilmente a cualquier estudio específico. Este video resumirá ahora los resultados típicos obtenidos mediante MTT.

Una parte sustancial del trabajo consiste en elaborar el algoritmo, que podría necesitar adaptarse a investigaciones específicas, como los modos de movimiento o interacciones bajo estrés. Sin embargo, ejecutar MTT es muy sencillo. Los usuarios solo deben optimizar algunos parámetros, como los límites espaciales y temporales.

Al elaborar MTT, nuestro objetivo fue reconsiderar completamente las opciones analíticas utilizadas para cada tarea. Optimizamos el proceso a lo largo de dos ejes desafiantes. Primero, abordar altas densidades para obtener la mejor información espacial posible sobre la superficie, y segundo, manejar una baja relación señal-ruido (SNR), lo que típicamente permite trabajar con baja eliminación y alta velocidad; además, el confinamiento puede interpretarse como la firma de una interacción subyacente.

Los receptores de membrana pueden interactuar con el citoesqueleto submembranal o con dominios ricos en lípidos, por ejemplo. Dichos eventos pueden investigarse mediante variaciones de confinamiento en el espacio y el tiempo. Las medidas dinámicas pueden compararse con enfoques complementarios como FRA F Cs o freight.

El código abierto está disponible para la investigación académica. Puede descargarse desde nuestra página web en CML punto univ if an S fr en la página de nuestros equipos, que proporciona un enlace para la descarga. También invitamos a los interesados del sector industrial a contactarnos.

Queremos agradecer especialmente a los miembros de nuestro equipo y de las instalaciones comunes por el apoyo y las fructíferas discusiones. Este proyecto cuenta con financiamiento del CNRS en c MAA University Pac Region National de La, y la Fundación Médica recibe apoyo de la liga controladora. Gracias por ver.