Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método sencillo y reproducible de compresión del nervio ciático y análisis en montaje completo de la reinervación muscular tras la compresión del nervio ciático. Esto se logra primero exponiendo el nervio ciático, incluyendo la colocación adecuada de los retractores quirúrgicos para asegurar un buen acceso al nervio. A continuación, se comprime el nervio con pinzas hemostáticas y se marca el nervio con carbón vegetal.

Luego, retire los músculos individuales inervados por el nervio ciático de la extremidad trasera. El paso final consiste en diseccionar los músculos individuales para el análisis en montaje completo tras la inmunotinción. En última instancia, los resultados demuestran que la compresión reproducible del nervio ciático puede realizarse de manera sencilla y que los montajes completos de músculos pueden utilizarse para analizar la regeneración subsiguiente.

La principal ventaja de este procedimiento es que proporciona una técnica sencilla y reproducible para comprimir el nervio ciático y evaluar posteriormente la regeneración axonal. Comience este procedimiento anestesiando el ratón para la cirugía mediante una mezcla de 100 miligramos por kilogramo de ketamina y 10 miligramos por kilogramo de xilacina, administrada por inyección intraperitoneal para minimizar el dolor posoperatorio. El ratón también recibe una inyección subcutánea de 10 miligramos por kilogramo de meloxicam.

A continuación, afeite cuidadosamente ambas ancas utilizando una maquinilla quirúrgica. Luego aplique crema depilatoria para fosas nasales para lograr la eliminación completa. Limpie la piel con un aplicador estéril con punta de algodón y solución antiséptica de Betadine.

A continuación, aplique una pomada oftálmica a los ojos con un aplicador estéril con punta de algodón. Coloque al ratón sobre una placa de acero inoxidable limpia encima de una manta homeotérmica precalentada y mantenga la temperatura del animal a 37 grados Celsius. Luego sujete todas las extremidades con cinta adhesiva.

Coloque cuidadosamente la extremidad trasera de forma simétrica para que la articulación de la rodilla forme un ángulo recto con el cuerpo. Posteriormente, cubra el campo quirúrgico con un campo estéril bajo el microscopio. Realice una incisión semicircular a través de la línea media.

Separar suavemente la piel de la musculatura subyacente y doblarla hacia atrás de vez en cuando. Aplicar aproximadamente 0,1 mililitros de solución salina estéril para mantener el sitio quirúrgico húmedo durante el procedimiento. A continuación, abrir el plano fascial entre el glúteo mayor y la cabeza anterior del bíceps femoral.

Para exponer el nervio ciático como control quirúrgico. El nervio ciático contralateral debe ser expuesto y movilizado, pero dejado intacto. Luego reposicionar y suturar la musculatura glútea.

Exponer el nervio ciático experimental de la misma manera con retractoras. Para facilitar la visualización, liberar suavemente el nervio ciático del tejido conectivo circundante utilizando un par de tijeras de iridectomía.

Luego, use la pinza fina 5 45 para colocar el nervio en la mordaza inferior de la pinza hemostática súper fina, alineando los tres fascículos adyacentemente, no uno encima del otro. La pinza hemostática ha sido grabada con una marca a 1,5 milímetros desde su punta. Coloque la porción más externa del ciático alineada con esta marca antes del aplastamiento.

Esto asegura una compresión de anchura uniforme y que el nervio no se extienda más allá de las puntas del fórceps hemostático cuando se aplana debido a la fuerza de compresión. Si el nervio se extiende más allá de las puntas del fórceps, solo se comprimirá parcialmente. Utilice un segundo par de fórceps hemostáticos que haya sido previamente sumergido y espolvoreado con carbono para marcar el sitio de compresión.

Aplique presión sobre el nervio en el mismo sitio de compresión durante 15 segundos con tres clics. No debe extenderse marca de carbono más allá del límite de la compresión inicial. Esto es particularmente importante si se requiere una marcación precisa del sitio de compresión, para lo cual se debe sumergir previamente la pinza en carbono y evitar así la dispersión del carbono en el sitio quirúrgico.

Abra la pinza en carbono en polvo. Luego, ciérrela suavemente. Utilice gasa estéril para limpiar el carbono del exterior de los hemostatos.

Revise la pinza bajo al menos tres aumentos para verificar que las superficies de compresión estén uniformemente recubiertas con carbono en polvo. Si es necesario, sumérjalas nuevamente y límpielas repose y sutures el músculo glúteo de la misma manera que en el lado contralateral. Finalmente, cierre la incisión cutánea utilizando los clips reflejos de nueve milímetros.

Si se encuentra que los clips de reflejo de nueve milímetros restringen el movimiento, pueden utilizarse clips de reflejo más pequeños o seis suturas autónomas. Alternativamente, tras sacrificar el ratón, retire cuatro músculos: el tibial anterior, el extensor largo de los dedos, el peroneo largo y el sóleo de la extremidad trasera, con cuidado, fijándolos mediante sus tejidos conectivos a un recipiente negro recubierto de cera.

Luego, enjuáguelos con PBS. Posteriormente, fíjelos en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Para diseccionar cada músculo en una placa de Petri negra recubierta, retire los tendones utilizando tijeras de iridectomía.

A continuación, adelgace los músculos separando cuidadosamente las fibras musculares internas. Preservar con cuidado la superficie externa del músculo, incluyendo las bandas de la placa motora. Luego, monte los músculos resultantes en portaobjetos con cubreobjetos de 22 por 40 milímetros y selle dos lados con esmalte transparente. Cuando estén adecuadamente montados sobre el portaobjetos, las bandas de la placa motora deben estar en contacto con los cubreobjetos.

Aquí se muestra un ejemplo de un sitio de compresión in situ en la extremidad trasera izquierda. El sitio de compresión está indicado por carbono negro. El asterisco marca una rama del nervio tibial que inerva la musculatura del muslo y sirve como un punto de referencia útil.

Durante la cirugía de compresión, la división tibial del nervio ciático se resalta en azul, la peronea en verde y la srel en amarillo. Esta sección semicorreída muestra una compresión completa realizada con pinzas hemostáticas. Las flechas indican las fibras comprimidas aquí.

Se indica una compresión incompleta realizada con fórceps angulados en otra sección semilunar. Las puntas de flecha indican nuevamente fibras comprimidas, mientras que las flechas indican axones preservados. Estas son las imágenes renderizadas de los músculos en preparación completa.

Tras la eliminación del tejido conectivo y el posterior afinamiento, se delimitan las bandas nplate en cada músculo. Se muestra aquí el músculo entero en montaje suiso. 14 días después de la compresión del nervio ciático.

Las flechas indican áreas de la unión neuromuscular que han sido reinnervadas por un axón. Aquí se muestra una demostración de la unión neuromuscular desinnervada. Los procesos de las células de Schwann positivos para la proteína GAP-43 se indican mediante las puntas de flecha.

No se observan axones en esta unión neuromuscular deservada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo comprimir de forma reproducible el nervio estático y preparar montajes de músculo con hormonas para el análisis de la regeneración.