Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Este protocolo está optimizado para encapsular células madre embrionarias humanas pluripotentes y diferenciarlas en neuronas dopaminérgicas en un sistema 3D. Primero, trate las colonias con inhibidor de ROCK o RI y disocie las células en células individuales con acuato mezclado con alginato de sodio, y páselas a través del dispositivo de encapsulación. Continúe el tratamiento con RI durante tres días, transfiera las células encapsuladas a las células PA seis y diferéncielas durante 28 días.

En última instancia, el análisis de la expresión génica y proteica muestra una mayor eficiencia en la generación de neuronas dopaminérgicas. La principal ventaja de esta técnica particular frente al protocolo de diferenciación 2D existente es que intentamos propagar y diferenciar estas células en un entorno 3D, y ese entorno 3D ofrece la oportunidad de propagar las células de manera altamente densa. Además, también brinda la posibilidad de lograr una mejor interacción entre células para la diferenciación.

Y en tercer lugar, también le proporcionará una mayor eficiencia de diferenciación a lo largo del proceso. Asimismo, si me permite añadir que esta técnica particular también puede adaptarse para otro tipo de células que podamos propagar en un entorno tridimensional. Ahora recuerde, por ejemplo, que esta técnica específica ha sido optimizada utilizando un inhibidor de rock que evita la apoptosis celular y también previene la desprendimiento de las células de las placas de cultivo.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio, ya que esta técnica no se realiza típicamente en cultivo de tejidos. La siguiente técnica de encapsulación ha sido optimizada según los estudios resumidos del Dr. Dean y el Dr. Chad sobre la aplicación del alginato de tipo inhibidor R, la concentración de alginato y los ajustes del dispositivo de encapsulación. Jamie y Kim, una estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, demostrarán ahora este protocolo.

Añada 25 mililitros de solución estéril de gelatina al 0,1 % a 275 miligramos de alginato de sodio purificado en un tubo estéril de 50 mililitros y mezcle en vórtex para disolver parcialmente el polvo de alginato. Luego, coloque el tubo en un mezclador orbital a 10 veces G durante la noche. A continuación, añada cloruro de sodio estéril al 9 % a la solución de alginato.

Vortexéese durante 30 segundos y luego centrifúguese a 95 veces G durante cinco minutos. Almacéese la solución de alginato a cuatro grados Celsius. Primero, en un ambiente oscuro, precúltivense las células madre embrionarias humanas con medio de cultivo suplementado con 10 micromolares de inhibidor de ROCK.

Incubar durante dos horas a 37 grados Celsius. Ahora lave las células dos veces con DPBS para desprender las células enzimáticamente. Añada accutane e incube durante 10 minutos.

A 37 grados Celsius, retire suavemente las células con un raspador celular y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros. Neutralice la Accutase con un volumen igual de medio SL. A continuación, pase las células neutralizadas a través de un filtro de 40 micrones hacia un tubo cónico fresco de 50 mililitros.

Ahora utilice un citómetro de hemocitos para enumerar las células. Haga un pellet de las células por centrifugación, deseche cuidadosamente el sobrenadante. Luego lave las células una vez con medio precalentado.

Cloruro de sodio al 0,9 %. Centrifugue su ganancia y deseche el sobrenadante. Para encapsular las células madre embrionarias humanas, comience por resuspender las células con la solución de alginato previamente calentada.

Para hacer esto, conecte una jeringa de 20 mililitros a un tubo de plástico blando y aspire el alginato hacia la jeringa. Luego, mezcle suavemente la suspensión celular usando la jeringa sin crear burbujas. Ahora aspire las células hacia la jeringa.

Deseche el tubo de plástico y luego conecte la jeringa a la máquina de encapsulación. Continúe con la configuración de los instrumentos del generador de perlas, la bomba de jeringa, el medidor de flujo de aire y el baño de precipitación de cloruro de calcio. Verifique un espacio de 10 centímetros entre el extremo de la máquina de encapsulación y el punto de recolección en la placa de Petri.

A continuación, ajuste la bomba de jeringa a 10 mililitros por hora. Flujo de aire a ocho litros por minuto y una presión de 100 kilopascales. Recopile las células encapsuladas en un baño de precipitación precalentado durante siete minutos.

Luego, transfiera con aspiración suave a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de cloruro de sodio al 0,9 %; permita que las cápsulas se sedimenten en el fondo del tubo, deseche cuidadosamente el sobrenadante y luego realice un lavado con cloruro de sodio al 0,9 %. A continuación, proceda a resuspender las células encapsuladas en medio de cultivo precalentado, suplementado con inhibidor ROCK. Transfiera a un frasco de cultivo e incube durante tres días.

Siembre las células de la línea estromal de ratón PA six en un matraz T75 recubierto con gelatina al 0,1 % e incorpore el medio de diferenciación neural dopaminérgica para su acondicionamiento durante 24 horas. Transfiera las cápsulas a un tubo cónico de 50 mililitros y déjelas sedimentar hasta el fondo del tubo. Deseche el sobrenadante y resuspenda las cápsulas en el medio de diferenciación neural dopaminérgica acondicionado con células PA six.

Cultivo en medio. Las células madre embrionarias humanas encapsuladas con la monocapa de células PA6 durante 21 días. Al reponer el medio, cámbielo.

Solo la mitad del medio cada vez continúa cultivando las células PA6 en diferenciación neural dopaminérgica. Incubar con medio suplementado con factores inductores durante una semana. Primero aspire las cápsulas y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros.

Una vez que las cápsulas se hayan sedimentado en el fondo, deseche el sobrenadante. Lave dos veces con DPBS, descartando el sobrenadante. A continuación, agregue cinco mililitros de solución decapulante y mezcle bien la suspensión.

Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar el precipitado, retire las células decap y lávelas dos veces con DPBS; luego proceda a utilizar las células decap ya sea como cultivo de monocapa o para análisis inmediato aguas abajo. En una preparación típica, el diámetro de los microcápsulas de alginato está entre 400 y 500 micrones.

Aquí, ensayo C-F-D-A-P-I. Los resultados determinan las células encapsuladas viables verdes al 80%. Los análisis de viabilidad, proliferación y apoptosis de células madre embrionarias humanas encapsuladas en diferentes puntos temporales sirven para optimizar las condiciones de cultivo. Curiosamente, los efectos del inhibidor de rock previenen la apoptosis inducida por disociación y mantienen la viabilidad celular con indicios de un crecimiento superior de las células madre embrionarias humanas encapsuladas cultivadas en H-F-F-C-M más ri.

Este ejemplo aplica la encapsulación celular como una plataforma tridimensional para diferenciar células madre embrionarias humanas encapsuladas en neuronas dopaminérgicas. Como se esperaba, el tamaño de los cuerpos embrionarios aumenta con el tiempo; las células desencapsuladas muestran una morfología neuronal progresiva tras dos o tres días de cultivo, con una viabilidad superior al 90 %. El análisis de expresión génica indica una regulación a la baja del marcador de pluripotencia OCT4.

Es importante destacar que el marcador de progenitor neuronal PAC seis y el marcador de neuronas dopaminérgicas TH permanecen sobreexpresados tras siete días de diferenciación. Las células madre embrionarias humanas diferenciadas más ampliamente muestran más del 90 % de neuronas positivas para TH tras 21 días. El análisis por inmunotransferencia confirma los patrones de expresión favorables de TH y PAC seis en sistemas de cultivo celular en 3D frente a los sistemas en 2D.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse eficazmente en dos horas. Recuerde tratar las células con inhibidor de rock antes y después de la encapsulación. Inductores o inhibidores variantes pueden adaptar el protocolo de diferenciación en 3D para experimentos futuros.

Esta técnica particular de encapsulación de ESL humanas y su diferenciación en un entorno tridimensional tiene potencial para la terapia celular en una serie de enfermedades, particularmente la enfermedad de Parkinson.