Evaluación de la expresión de GFP y viabilidad mediante el Tali basada en imágenes citómetro

Este video demuestra un procedimiento para determinar la viabilidad celular en células que expresan GFP utilizando el citómetro basado en imágenes tally. Las células transducidas con GFP se tiñen usando el kit de viabilidad tally dead cell red, que tiñe de rojo todas las células muertas con yoduro de propidio; las células se transfieren mediante pipeta a una lámina de análisis celular tally y se cargan en el citómetro, el cual adquiere y analiza imágenes de campo claro y de fluorescencia roja y verde. Luego se generan histogramas para mostrar el recuento celular, el tamaño celular, la intensidad de fluorescencia de PI y la intensidad de fluorescencia de GFP en comparación con la citometría de flujo tradicional.

Tali puede proporcionar datos similares sobre viabilidad celular y expresión. Sin embargo, esta citometría basada en imágenes ofrece información visual adicional acerca de la población celular que se examina. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la citometría de flujo o la microscopía de fluorescencia es que el citómetro Tali basado en imágenes proporciona simultáneamente información cuantitativa y visual sobre su muestra celular.

Además, el instrumento tally es más fácil de usar, es menos costoso y tiene un menor tamaño en comparación con un citómetro de flujo o un microscopio de fluorescencia. Esto permite a los investigadores realizar rápidamente ensayos cuantitativos, como la viabilidad en células que expresan GFP, directamente sobre la mesa de trabajo. En este procedimiento, células U2 OS a una concentración de uno por diez a la seis células por mililitro se transdujeron con un constructo viral GFP CellLight dirigido al núcleo para detectar células muertas con yoduro de propidio; transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Téngase en cuenta que se recomienda una concentración de uno por diez a la quinta hasta uno por diez a la séptima células por mililitro para el ensayo, aunque la concentración no tiene que ser exacta. A continuación, agregue un microlitro del reactivo Tally Dead Cell Red. Luego, vortexee brevemente para mezclar e incube la mezcla de células y reactivo de tinción a temperatura ambiente y en la oscuridad durante uno a cinco minutos.

Tras la incubación, proceda inmediatamente al análisis en el citómetro basado en imágenes tally. El tally utiliza láminas desechables de plástico diseñadas específicamente para el instrumento para el análisis celular. Asegúrese siempre de sostener la lámina por los bordes al cargarla.

Pipetee lentamente 25 microlitros de muestra en una de las áreas de carga de muestra con forma de media luna. Aquí, las células control no transducidas sin teñir se cargan en la cámara A y las células teñidas que expresan GFP se cargan en la cámara B. Para realizar un ensayo de viabilidad en células que expresan GFP, toque G-F-P-R-F-P en la pantalla principal del citómetro. Luego, las opciones del ensayo aparecerán a la derecha; seleccione GFP más viabilidad.

El instrumento preguntará entonces si se debe asignar un nombre a la serie de muestras. Pulse «nombrar ahora». A continuación, utilizando la pantalla táctil, escriba el nombre de la serie de muestras y pulse «guardar»; el citómetro de conteo avanzará automáticamente a la pantalla de medición.

A continuación, para medir la fluorescencia de fondo, presione la pestaña de fondo en la mitad inferior derecha de la pantalla de medición, como se puede ver aquí. La configuración predeterminada indica que se obtendrán imágenes de nueve campos de células. Ahora, con la muestra de control orientada lejos del instrumento, inserte el portaobjetos en el puerto de carga hasta que se detenga.

No aplique fuerza sobre la pantalla táctil de fondo al presionar para insertar el control de células no teñidas. El portaobjetos será introducido automáticamente en el instrumento y se mostrará en la pantalla una imagen en vivo de las células. Utilice el mando de enfoque para colocar las células en el plano adecuado mientras enfoca.

Deslice el botón de zoom rojo hasta 4 x o 16 x. Para observar mejor la población celular, las células deben presentarse uniformemente oscuras con un halo brillante alrededor de cada una. Como se muestra aquí, puede subestimarse el recuento de células cuando la transición entre el fondo y los bordes de las células es borrosa, de modo que los límites celulares no estén bien definidos.

Las células pueden contarse en exceso cuando tienen centros brillantes y periferias oscuras. Una vez que las células hayan sido enfocadas, toque o presione para ejecutar el control de células no teñidas. Para medir la fluorescencia de fondo, el citómetro capturará automáticamente imágenes y mostrará miniaturas de cada campo de visión.

La barra de progreso proporciona actualizaciones continuas del análisis. Una vez completada la captura de imágenes, el citómetro expulsa automáticamente el portaobjetos y proporciona los datos del análisis de las imágenes capturadas. Los datos almacenados se muestran en el menú desplegable de la pestaña de fondo.

La muestra de control de fondo recibirá el mismo nombre que el asignado al experimento. Para analizar la muestra transducida con GFP teñida con yodo de propidio, retire la placa del instrumento, inviértala y vuelva a insertarla con la muestra transducida orientada en dirección opuesta al instrumento. Presione la pestaña de muestra y luego toque presionar para insertar la nueva muestra.

Cuando la imagen aparezca en la pantalla, use el botón de enfoque para enfocar las células. Como antes, luego toque y presione para ejecutar la muestra. Una vez completada la captura de la imagen, los datos del análisis aparecen bajo la pestaña de muestra y el citómetro expulsa automáticamente la portaobjetos de forma adecuada.

Deseche la diapositiva de análisis celular de conteo. Como residuo biopeligroso, estas diapositivas no pueden reutilizarse. Una vez que se haya procesado la muestra, se pueden aplicar umbrales a la muestra.

Para analizar poblaciones celulares específicas aquí, ajustaremos los umbrales para determinar el porcentaje de células vivas y muertas. En las células que expresan GFP bajo la pestaña de muestra, se muestra el número y porcentaje de células que expresan GFP, el número de células vivas que expresan GFP, el número de células muertas que expresan GFP, la viabilidad total, el tamaño celular promedio, el número de células contadas y la concentración celular.

Además, en la parte inferior de la pantalla se muestran gráficos de histograma que muestran el tamaño celular, la fluorescencia verde y la fluorescencia roja. Para establecer la compuerta del tamaño celular, toque la miniatura del tamaño celular para abrir el histograma del tamaño celular y excluir cualquier detrito. Mueva las barras deslizantes azules para excluir eventos grandes y pequeños.

Toque para aplicar y incluir las células dentro de las compuertas. A continuación, para agregar la fluorescencia GFP al análisis, toque la miniatura del histograma de GFP. Para abrirlo.

Mueva la barra deslizante azul para ajustar el umbral justo a la derecha del pico más tenue. Utilice la muestra de control como guía. Esto permite que el análisis incluya las células positivas para GFP, pero excluya las células autofluorescentes.

La autofluorescencia se observa frecuentemente cuando las moléculas biológicas dentro de las células se excitan. Aplique toque para confirmar y regrese a la pantalla anterior. Los datos mostrados bajo la pestaña de muestra ahora deben reflejar las compuertas y el umbral establecidos para ambos canales de fluorescencia. A continuación, para separar las células teñidas con PI de la autofluorescencia o cualquier fondo presente en la muestra, presione la miniatura del histograma de PI para abrirlo nuevamente.

El pico de la muestra de control se mostrará como un pico gris en el histograma. El pico rojo es la fluorescencia de la muestra. La fluorescencia de fondo se muestra como un pico cercano al valor cero de RFU en este instrumento.

Para eliminar la fluorescencia de fondo en el canal de PI, mueva la barra deslizante azul para ajustar el umbral. Para excluir este pico, utilice el pico gris de la muestra de control como referencia. Cuando el umbral en el canal de PI se haya ajustado adecuadamente, toque aplicar para confirmar y regresar a la pantalla anterior; el instrumento volverá a analizar automáticamente los datos y actualizará los resultados en la pestaña de muestra.

A continuación, para confirmar visualmente que cada célula esté correctamente asignada, presione la pestaña de zoom y luego seleccione un campo de visión capturado para revisión presionando la miniatura de la imagen. A continuación, presione la pestaña de capas. Luego, presione el botón GFP o PI para mostrar la imagen capturada a través de ese canal.

Pulse el mismo botón nuevamente para eliminar la capa de la visualización o para superponer capas; toque los botones correspondientes a cada canal para identificar cómo se cuentan las células a través de un canal determinado. Toque los círculos que rodean las células que fueron contadas únicamente mediante el canal de campo brillante; las que no expresan fluorescencia se marcarán con un círculo azul. Esto indica que una célula particular está viva y expresando en el canal verde.

Se rodearán con un círculo verde las GFP en las células que expresan en el canal rojo. Las células teñidas con PI se rodearán con un círculo rojo y se contarán como células muertas en ambos casos. Se rodearán con un círculo amarillo las células que aparecen en los canales rojo y verde.

Esto indica que la célula expresa GFP pero también está teñida con pi y, por lo tanto, está muerta. Ocasionalmente, aparecerá un círculo negro en la pantalla. Estos son objetos que han sido identificados pero que han sido excluidos del análisis según el tamaño celular.

Continúe ajustando finamente el umbral en el histograma de fluorescencia utilizando los pasos descritos anteriormente hasta que cada célula que expresa fluorescencia quede encerrada con el color adecuado. Todos los parámetros de análisis se guardan automáticamente en el instrumento bajo la pestaña de datos.

El dispositivo puede almacenar archivos de datos de 500 corridas de muestra. Cada archivo almacenado en la pestaña de datos está disponible para su reanálisis. Al seleccionar el archivo desde la pestaña de datos, este se volverá a abrir y todos los histogramas y capas quedarán activos para archivar datos y generar informes.

Los datos almacenados en el instrumento pueden transferirse a una computadora mediante una unidad USB. Cuatro tipos representativos de células fueron transducidos con un constructo viral GFP dirigido al núcleo, marcados con el kit de viabilidad tally utilizando el reactivo dead cell red y analizados mediante el tally en un citómetro de flujo como se muestra aquí. Ambos métodos informaron aproximadamente el mismo porcentaje de la población para cada tipo celular que expresaba GFP, junto con el porcentaje de la población total que era viable y expresaba GFP.

Estos datos demuestran que el citómetro Tali es capaz de discriminar entre la expresión total de GFP en una población y la expresión de GFP en la población viable. Acabamos de demostrar cómo utilizar el citómetro basado en imágenes Tali para evaluar la expresión de fluorescencia y la viabilidad en su muestra celular. Esta tecnología reduce la brecha entre los estudios de células individuales y poblacionales.

Utilizando el citómetro basado en imágenes de conteo, puede recopilar información visual cuantitativa y cualitativa sobre células individuales así como sobre poblaciones celulares más grandes. Mediante el mismo procedimiento, se pueden realizar varios ensayos adicionales, incluyendo apoptosis, expresión de RFP y viabilidad celular. Para células no expresoras, las aplicaciones potenciales incluyen la evaluación de la expresión génica hasta estudios de la eficacia de fármacos.