Preparación de la muestra de

El objetivo de este procedimiento es analizar extractos libres de células de Mycobacterium tuberculosis mediante metabolómica por RMN. Primero, cultive y coseche las células en una etapa adecuada de crecimiento. Luego, lise las células y obtenga los extractos libres de células para su análisis. Resuspenda los extractos liofilizados en tampón para el análisis por RMN.

Finalmente, recopile datos de RMN y analice los espectros con software para identificar los metabolitos. En última instancia, el análisis de RMN de Mycobacterium tuberculosis se utiliza para mostrar las preservaciones en los niveles de metabolitos tras diversos tratamientos. La metabolómica por RMN puede aplicarse a aspectos clave de la fisiología de Mycobacterium tuberculosis, como las vías metabólicas importantes.

Esta comprensión es fundamental para elucidar los mecanismos de acción y resistencia de los fármacos y para identificar nuevos blancos para el diseño de medicamentos. En general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades debido a la incapacidad para manipular todas las muestras de manera idéntica, lo que introduciría variaciones innecesarias y resultados de mi laboratorio. Steven Luka, estudiante de doctorado, demostrará los procedimientos para manipular las muestras para el procesamiento por RMN. De mi laboratorio, la responsable del laboratorio de investigación y Robert Fenton, técnico de investigación tres, demostrarán ahora los procedimientos para manipular cultivos de Mycobacterium tuberculosis al realizar M. tuberculosis.

La investigación siguió las prácticas de nivel de bioseguridad tres según lo definido por las directrices institucionales. Aunque las etiquetas en este video digan microbacterium tuberculosis por consideraciones de bioseguridad, esta demostración utilizó la mycobacterium magmatic no patógena. Comience por descongelar un stock de glicerol al 50 % de M tuberculosis en hielo.

Inocular 0,15 mililitros en 110 mililitros de caldo M-A-D-C-T-W en el matraz ER y mi matraz, y cultivar las culturas a 37 grados Celsius con agitación a 100 RPM durante aproximadamente seis días. Si no se necesitan antibióticos, adiciones alternativas u otros tratamientos, cosechar las culturas para aquellas que requieran tratamientos.

Reserve 0,5 mililitros de Eloqua en hielo para el cultivo, la titulación y el control de calidad. A continuación, realice el tratamiento deseado y devuelva los cultivos al agitador después del período de tratamiento. Retire un mililitro y determine la DO a 600 nm.

Además, reserve una muestra de 0,5 mililitros para cultivo, titulación y control de calidad. Mantenga las células en hielo durante todo el resto del protocolo. Recoga las células en cuatro tubos de 50 mililitros mediante centrifugación tras lavarlas con 15 mililitros de agua doblemente destilada fría en hielo.

Reese suspenda los pellet en alícuotas de 10 mililitros. Tome dos alícuotas y precipite mediante centrifugación, luego resuspenda el pellet celular en un volumen final de un mililitro de agua doblemente destilada. Si se desea una suspensión de células individuales libre de agregados, pase las células a través de una aguja de calibre 27.

Proceda tres veces a transferir la suspensión celular de un mililitro a un tubo de dos mililitros con tapón roscado que contenga la matriz de lisis B. Coloque el homogeneizador de lisis Fast Prep 24 dentro de la cabina de seguridad biológica. Coloque las muestras en el portamuestras asegurando la placa de radios de retención. A continuación, procese durante 60 segundos a una velocidad de seis metros por segundo.

A continuación, centrifugue las muestras para obtener un sedimento de restos celulares y células íntegras. Luego, pase el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrones hacia un tubo estéril para asegurar la ausencia de células viables. Inocule 0,1 mililitro de muestra en MADC.Agar.

Congele las muestras en un baño de hielo seco con etanol y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para liofilizarse y procesarse en una instalación de RMN. Después de dos meses, revise las placas para verificar la ausencia de unidades formadoras de colonias. Si no se encuentran unidades formadoras de colonias, las muestras pueden retirarse del laboratorio BSL-3 para un análisis adicional en una instalación estándar de RMN.

Después de llevar las muestras a sequedad, resuspéndalas en 0,7 mililitros de tampón para RMN y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga. Centrifugue durante tres minutos a 13.000 ×g, retire 0,6 mililitros y transfiéralos a un tubo de RMN de cinco milímetros. Para el análisis de medios, un soporte personalizado facilita la carga de múltiples tubos de RMN en los portamuestras a la profundidad correcta.

Luego, transfiera las muestras al espectrómetro de RMN para insertarlas en el cambiador de muestras A-B-A-C-S de 20 posiciones. Alterne entre cultivos no tratados y tratados con fármaco. La primera muestra debe cargarse previamente en el imán al inicio de un análisis automatizado.

Para calibrar el instrumento, optimice la duración del pulso de 90 grados con una sola muestra y sintonice el instrumento para las muestras restantes. Utilice el icono de RMN y gradiente de shim. Automatice el bloqueo, el ajuste de shim y la recopilación de datos de RMN para cada muestra.

Para un espectro de RMN de hidrógeno 1D, seleccione la secuencia de pulsos con supresión de agua y esculpido de excitación. Establezca un total de 32.000 puntos de datos, 128 escaneos y 16 escaneos simulados para un espectro de dos DH uno C 13 hs QC. Seleccione la secuencia de pulsos.

Seleccione un total de 2048 puntos de datos con un ancho de barrido a lo largo de la dimensión directa H y 64 puntos de datos con un ancho de barrido a lo largo de la dimensión indirecta C 13. Asimismo, especifique la adquisición del espectro con 128 escaneos y 16 escaneos ficticios para obtener una buena relación señal-ruido. Un espectro de m tuberculosis generó aproximadamente 400 picos, incluyendo 50 metabolitos conocidos.

Por ejemplo, el procesamiento de datos detallado en el manuscrito adjunto produjo este espectro de metabolitos que están directa o indirectamente asociados con la vía de la D-alanina. La magnitud de las intensidades de los picos es proporcional a las concentraciones de metabolitos presentes en el extracto celular, por lo que se pueden cuantificar las perturbaciones relativas en metabolitos y vías metabólicas entre muestras y tratamientos. La metabolómica LMR allana el camino para que las investigaciones en el campo de la bacteriología exploren la fisiología y la patogénesis en microbacterias visuales y otros microorganismos patógenos o no patógenos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar múltiples extractos celulares de tuberculosis para metabolómica por RMN, y lo más importante, mantener la consistencia a lo largo de todo el protocolo para obtener resultados confiables.