La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

El objetivo general de este procedimiento es detectar y cuantificar el grupo de toxina que ingresa al citosol. Para lograrlo, primero se une la toxina a la superficie de la célula huésped a cuatro grados Celsius. Luego se elimina la toxina no unida y las células se calientan a 37 grados Celsius, lo que permite el desplazamiento de la toxina hacia el sistema de endomembranas y, posteriormente, al citosol del huésped. A continuación, se utiliza dig tonin para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática tras la permeación celular.

Los extractos celulares se separan en fracciones membranal y citosólica utilizando la centrifugación diferencial como paso final. La resonancia de plasmones de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) abreviada como SBR se utiliza para detectar y cuantificar la entrada de toxinas al citosol mediante la perfusión de la fracción citosólica sobre un sensor SPR recubierto con un anticuerpo antitoxina. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo de la biología de toxinas, como la eficiencia y la cinética de la entrada de toxinas al citosol, la cantidad de toxina que ingresa al citosol y la posible inhibición farmacológica del tráfico de toxinas hacia el citosol. Antes de comenzar este protocolo, prepare las células heli para la intoxicación celular según se describe en el protocolo escrito, tras una incubación nocturna de las células HeLa.

Sustituya el medio de cultivo por un mililitro de DMEM que contenga 100 nanogramos por mililitro de gangliósido GM1 e incube durante una hora a 37 grados Celsius. Esto aumenta el número de sitios de unión para la toxina del cólera. Dado que el GM1 actúa como receptor de la toxina, se intercala en la membrana plasmática de las células expuestas a una solución de GM1.

Después de una incubación de una hora, retire el medio que contiene el GM y lave las células dos veces con DMEM. A continuación, agregue un mililitro de DMEM que contenga un microgramo por mililitro de toxina del cólera y coloque las células a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Retire el medio que contiene la toxina y lave las células dos veces.

Luego, incubar las células en un mililitro de DMEM a 37 grados Celsius durante el tiempo deseado. Al final de cada período de seguimiento, lavar las células con PBS y luego incubar cada pocillo con 250 microlitros de EDTA 0,5 milimolar en PBS. Tras una incubación de 10 minutos en hielo, retirar las células de la placa de seis pocillos mediante agitación vigorosa con un pipeteo P1000.

Después de haber recolectado una poceta de células, combínela con la segunda y luego con la tercera poceta de la misma condición. A continuación, coloque la suspensión celular combinada de las tres pocetas replicadas en un único tubo de microcentrífuga. Ahora, centrifugue el tubo de microcentrífuga en una microcentrífuga de mesa durante cinco minutos.

Se deben obtener pellets celulares de tamaño aproximadamente equivalente a 5.000 × g para todas las condiciones. Deseche el sobrenadante y luego resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de una solución de trabajo al 0,04 % previamente preparada y enfriada de digitonina. Coloque la suspensión celular en hielo durante 10 minutos; utilizando una microcentrífuga de banco, centrifugue la digitonina y las células permeabilizadas a 16.000 × g durante 10 minutos.

Transfiera el citosol que contiene la fracción sobrenadante a un tubo fresco de microcentrífuga y conserve la fracción de pellet que contiene orgánulos. Los patrones de la toxina SPR se preparan en concentraciones de ciento diez, uno y 0,1 nanogramos por mililitro en tampón HCN. Las muestras se preparan diluyendo fracciones sobrenadantes que contienen citosol en tampón HCN hasta un volumen final de un mililitro. Son necesarios volúmenes de muestra de al menos un mililitro para asegurar que el aire sea expulsado del bucle de muestra de 500 microlitros antes de la inyección. Las fracciones de pellet que contienen orgánulos se resuspenden en un mililitro de tampón HCN que contiene 1 % de Triton X-100.

La adición de detergente es necesaria para liberar la fracción de toxina atrapada en la membrana. Además, prepare conjuntos paralelos de fracciones citosólicas y de orgánulos L para un experimento control que confirme la fidelidad del procedimiento de fraccionamiento; suspenda la fracción citosólica en 20 microlitros de tampón de muestra cuatro x y la fracción de orgánulos L en 120 microlitros de tampón de muestra uno x. Resuelva volúmenes equivalentes de cada fracción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) e investigue mediante análisis Western blot para demostrar la distribución de una proteína citosólica en la fracción sobrenadante y de una proteína soluble del retículo endoplásmico (RE) en la fracción de precipitado. Para preparar el portaobjetos de SPR, primero coloque un portaobjetos de vidrio recubierto de oro con una monocapa autoensamblada en el instrumento de SPR.

Activee la lámina sensora perfundiendo una solución de E-D-C-N-H-S sobre la lámina durante 10 minutos a un caudal de 41 microlitros por minuto. En todas las perfusiones subsiguientes, utilizamos el mismo caudal. Elimine el tampón de activación E-D-C-N-H-S lavando la placa durante cinco minutos con PBS que contenga 0.05%2020.

La placa ahora contiene anclas MI reactivas debido a la eliminación del bloqueo mediante la solución E-D-C-N-H-S. A continuación, pase una solución de anticuerpo anti-CTA sobre la lámina sensora activada a una dilución de uno a 20.000 en acetato de sodio 20 milimolar durante 15 minutos. Se observará una caída inicial en la unidad de índice de refracción, abreviada como RIU, debido al cambio de pH.

A continuación, se producirá un aumento en la RIU a medida que el anticuerpo sea capturado por los enlaces reactivos de amida. En el portaobjetos sensor, elimine el anticuerpo no unido del portaobjetos con un lavado de PBST durante cinco minutos. La señal de RIU generada por el anticuerpo capturado alcanzará una meseta y se estabilizará, proporcionando una nueva señal de línea base.

Como paso final en la preparación del portaobjetos, PASE una solución de etanolamina un molar sobre el portaobjetos sensor durante cinco minutos. Esto satura e inactiva cualquier anclaje no unido que quede en el portaobjetos sensor. La señal de RIU aumentará para establecer una lectura de referencia; pase PBST sobre el sensor recubierto con anticuerpo durante cinco minutos.

Luego, perfundir una muestra experimental o un estándar de toxina sobre el sensor durante 300 segundos. Eliminar el ligando del tampón y perfundir PBST sobre el sensor durante otros 200 segundos. Cualquier toxina que permanezca unida al sensor se elimina mediante un 102.º lavado con PBST a pH 5,0.

Esto devolverá la señal a su lectura inicial de línea base, permitiendo así procesar otra muestra en el mismo sensor. Antes de cargar una nueva muestra, impulse una pequeña cantidad de aire a través del bucle de muestra para expulsar cualquier fluido residual de la muestra anterior. Tras la adquisición.

Los datos pueden analizarse con el software Scrubber Two y el software Igor puede utilizarse para la preparación de figuras. La toxina de la pertussis es una toxina AB que se traslada desde la superficie celular hasta el RE antes de que su cadena A entre en el citosol.

El ensayo de translocación basado en SPR pudo detectar PTs en el citosol de células CHO intoxicadas. No se generó ninguna señal a partir del citosol de células no intoxicadas, lo que confirmó la especificidad anti-PTs. Un anticuerpo no mostró reacción cruzada con un componente del citosol del huésped.

La fracción de citosol de células intoxicadas en presencia de felden. A también falló en producir una señal positiva; el BFA previene el transporte de la toxina hacia el sitio de translocación en el RE, y por lo tanto, la entrega de la cadena H al citosol. La colétoxina es otra toxina del tipo AB que se transloca a través del RE.

Se detectó la CTA1 en la fracción citosólica de células helo tratadas con CT. Esto destacó que la metodología funciona con múltiples tipos celulares y puede aplicarse a cualquier toxina para la cual esté disponible un anticuerpo contra la cadena A. No se detectó señal alguna cuando la fracción citosólica de células tratadas con CT se hizo pasar sobre un sensor SPR recubierto con un anticuerpo anti-CTB, demostrando así que, a diferencia de la subunidad CTA1, el pentámero de CTB, responsable de la unión celular, no ingresa al citosol.

Después de la perfusión sobre un sensor SPR recubierto con un anticuerpo anti-CTA. La señal de la fracción de orgánulos está fuera de escala en comparación con la señal más débil de la fracción citosólica. Esto es consistente con la conocida ineficiencia del transporte de CT hacia el sitio de translocación del RE, lo que a su vez limita la cantidad de toxina que puede alcanzar el citosol.

La acumulación dependiente del tiempo de la toxina citosólica translocada también puede ser monitoreada. Tras la exposición celular a CT a cuatro grados Celsius, ninguna toxina fue detectada en el citosol 15 minutos después de elevar la temperatura a 37 grados Celsius.

Se detectó un pequeño grupo de toxina citosólica a los 30 minutos a 37 grados Celsius, y cantidades progresivamente mayores de toxina citosólica se detectaron tras los intervalos de seguimiento de 45 y 60 minutos. Esto demuestra una entrega continua a largo plazo de la toxina asociada a la célula hacia el citosol hospedado. El ensayo también puede detectar la inhibición de la translocación de la toxina al citosol; las células tratadas con 10 %DMSO mostraron niveles bajos de CT en el citosol en comparación con las células de control intoxicadas no tratadas y con el desdoblamiento de la toxina.

Una cadena es un requisito previo para la translocación al citosol, por lo que la estabilización inducida por DMSO de CT A uno previno en consecuencia su movimiento desde el RE al citosol. Para cuantificar el bloqueo inducido por DMSO en la translocación de la toxina, se utilizó una curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de toxina para calcular una concentración citosólica de cta, uno de 0,3 nanogramos por mililitro en células no tratadas y de 0,1 nanogramos por mililitro en células tratadas con DMSO. La inhibición del desenrollamiento de CT A uno por DMSO generó así una reducción tres veces mayor en la translocación desde el RE al citosol de CTA uno.

Tras seguir este procedimiento, podremos utilizar otras técnicas, como ensayos de intoxicación, para establecer una relación directa entre la cantidad de toxina presente en el citosol y la actividad de la toxina.