Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar cómo detectar con precisión y especificidad los metabolitos del óxido nítrico en muestras biológicas. Esto se logra procesando primero las muestras de sangre inmediatamente después de su recolección para evitar la pérdida de metabolitos o la formación de artefactos. Al mismo tiempo, se realiza una extracción rápida y eficiente de tejidos para minimizar los efectos de un entorno hipóxico sobre los metabolitos del óxido nítrico.

Se recolectan anillos aórticos y se suspenden en un baño de órganos para evaluar su función endotelial. Además, se utilizan ensayos bioquímicos para cuantificar los niveles de nitrato, niveles de nitrito y los niveles relativos de nitro tiololes y otros productos nitrosados en el tejido. Mediante estos ensayos, una comparación adecuada entre animales experimentales y controles puede generar información valiosa sobre la producción y el metabolismo del óxido nítrico.

La principal ventaja de utilizar este enfoque multisistémico frente a métodos o ensayos individuales es que permitiría obtener una visión más amplia de la bioquímica del óxido nítrico en múltiples sistemas orgánicos. Así, podemos comenzar a comprender cuáles de estos metabolitos podrían tener utilidad pronóstica o diagnóstica, y cómo el repertorio de metabolitos del óxido nítrico refleja la formación y disponibilidad de óxido nítrico endotelial. La demostración visual de este método es fundamental, ya que cada paso del proceso es crucial para mantener la integridad de la muestra.

Algunos de estos pasos no son evidentes al leer la sección de métodos en una revista típica debido al detalle fino de la recolección de muestras y la extracción de tejidos. Este procedimiento será demostrado por la Dra. Hong Jing, científica investigadora sénior en mi laboratorio. Para este protocolo, se debe tener disponible una persona o un animal experimental para la recolección de sangre, y en el caso de los animales experimentales, también se examinarán sus tejidos.

Primero, recolecte sangre completa insertando una aguja de 25 gauge en la vena cava inferior. Una vez recolectados entre 500 y 1000 microlitros, perfunda al animal para eliminar la sangre restante infundiendo un tampón fisiológico a través del ápice del ventrículo izquierdo y permita el reemplazo completo de la sangre mientras esta y el tampón salen por la vena cava inferior. La sangre venosa debe recolectarse inmediatamente después de la extracción en tubos centrífugos de 1,5 mililitros que contengan NEM y EDTA.

Centrifugar la sangre a 14.300 RCF durante siete minutos. Aspirar el plasma del sedimento de glóbulos rojos con una pipeta y transferirlo a un tubo separado. Preparar las muestras de plasma aislado para HPLC añadiendo primero un volumen igual de metanol frío a 50 microlitros de la recolección de plasma.

Vortexee la mezcla vigorosamente durante tres a cinco segundos hasta que se vuelva turbia. Luego, centrifugue la mezcla a 14,300 RCF durante siete minutos. Para precipitar las proteínas plasmáticas, recoja el sobrenadante en un tubo separado de 1,5 mililitros y almacénelo a cuatro grados Celsius hasta que pueda analizarse.

Para preparar el plasma para el análisis de quimioluminiscencia, tome el volumen restante de plasma, que debería ser de alrededor de 200 a 400 microlitros, y divídalo en dos volúmenes. Prepare la mitad del plasma añadiendo un 10% en volumen de sulfuro acidificado al 5%, y espere 10 minutos. Esta muestra ya está lista para el análisis mediante CLD.

Prepare la otra mitad del plasma añadiendo un 10% en volumen de cloruro mercúrico al 2% después de cinco minutos. A temperatura ambiente, agregue un 10% en volumen de sulfonamida acidificada. Espere otros 10 minutos e inyecte esta muestra en el CLD como si fuera plasma.

El sedimento de GR puede prepararse para HPLC y CLD para cualquiera de los análisis. Comience mezclando una parte de sedimento celular con cuatro partes de solución hipotónica de lisis. Vortexe la mezcla completamente para el análisis de CLD.

La preparación de las células es la misma que se realiza para el plasma. Comience añadiendo un volumen igual de metanol. Luego, vortexe la mezcla vigorosamente durante tres a cinco segundos, seguido de centrifugarla durante siete minutos a 14.300 RCF.

Ahora pipete el sobrenadante y almacénelo a cuatro grados Celsius hasta que se pueda analizar mediante HPLC para determinar los niveles tisulares de metabolitos del óxido nítrico. En los tejidos de interés procedentes de animales experimentales, primero debe recolectarse y prepararse la sangre según se describió en la sección anterior; la recolección de los tejidos debe realizarse de forma habitual, prestando especial atención a la rapidez y eficiencia para que los tejidos no se vuelvan hipóxicos. Una vez recolectados, homogenice las muestras de tejido en una proporción de uno a cinco de PBS que contenga N-E-M-E-D-T-A.

Luego prepare los tejidos homogenizados para el análisis mediante HPLC y CLD, como se describió en las secciones anteriores para los GR. Después de anestesiar un ratón adulto con éter dátlico y confirmar que no responde a un pellizco en el dedo del pie, realice una toracotomía. Se realiza una incisión media desde el esternón hasta la región púbica para exponer las cavidades torácica y abdominal.

A continuación, perfunda el animal con tampón Krebs Alite oxigenado. Utilice una jeringa de 25 gauge para inyectar el tampón en el ápice del ventrículo izquierdo. Corte abierta la aurícula derecha para proporcionar una salida para la sangre.

Después de la perfusión, aísle la aorta abdominal cortando y eliminando el hígado, los pulmones y otros tejidos que puedan cubrir la aorta. A continuación, sostenga el corazón con un par de pinzas y seccione la aorta de la pared posterior del animal de manera suave. Coloque el corazón y la aorta en una placa de Petri llena de hielo.

Bufer frío de Krebs en la placa. Corte y limpie cuidadosamente la grasa y la adventicia de la aorta. Evite dañar el endotelio interno del vaso durante la limpieza.

Mantenga el metabolismo de las aortas lento para prevenir la hipoxia, transfiriéndolas a tampón oxigenado frío con hielo cada cinco minutos. Ahora use un escalpelo para cortar la aorta en segmentos anulares de tres milímetros de longitud. Transfiera los segmentos a un baño de órganos tisulares de cuatro canales de 10 mililitros, cargado con tampón de Krebs oxigenado.

Mediante el botón del transductor, aplique una pretensión de 1,5 gramos a cada anillo aórtico. Según hallazgos empíricos, 1,5 gramos es la tensión inicial adecuada para una función vasomotora óptima.

En el monitor del ratón, registre la medición de fuerza utilizando un puente octal de ocho canales y un software de adquisición de datos; permita que los anillos se equilibren durante 80 minutos, cambiando el tampón cada 20 minutos, y luego continúe con el experimento. Una vez que la tensión del tejido se haya equilibrado, agregue 100 nanomolar de fennel rine a cada anillo para provocar una contracción submáxima. Cuando la tensión del anillo se haya estabilizado y exista un nivel constante de tono, realice un análisis de respuesta a la dosis con un agonista endotelial como la acetilcolina.

Esto determinará la producción de óxido nítrico y el grado de relajación vascular. Después de la respuesta a la dosis de acetilcolina, enjuague los baños con tampón de Krebs y agregue 100 nanomolar de fennel rine a cada baño de órganos para contraer los vasos. Nuevamente, determine entonces la respuesta de los anillos de músculo liso a una fuente exógena de óxido nítrico, como el nitroprusiato de sodio, con y sin ODQ, un inhibidor de la guanilato ciclasa soluble.

Este tipo de enfoque determinará un valor de relajación del 100 % para los vasos y también demuestra la naturaleza esencial de la guanilato ciclasa soluble en la mediación de la respuesta del óxido nítrico a la relajación vascular. Dado que el ODQ impedirá la relajación frente al nitrato de sodio en respuesta a la acetilcolina, los anillos aórticos de ratones controles sanos se relajaron, mientras que los anillos aórticos de ratones con disfunción endotelial mostraron una relajación reducida debido a una disminución en la producción de óxido nítrico. También se realizaron ensayos de desnitratación específicos por grupo en los animales control, mediante quimioluminiscencia del nitrito.

Se detectaron RSNO y RNNO utilizando un ensayo reductivo de desnitrosación. Al restar las áreas de los picos, se midieron los niveles de nitrito y r sno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del óxido nítrico y vascular, como, ¿cómo reflejan los niveles circulantes de estos metabolitos del óxido nítrico los niveles tisulares?, y ¿cómo cambian los metabolitos de la enfermedad en distintas condiciones patológicas?

La determinación de las concentraciones en estado estacionario y la semivida de estos metabolitos relevantes del óxido nítrico en múltiples sistemas orgánicos y en toda la circulación de un solo animal permitirá la identificación de firmas moleculares específicas de procesos patológicos y nos ayudará a definir nuevas modalidades de tratamiento basadas en el óxido nítrico, lo que permitirá al clínico contar con mejores biomarcadores de la gravedad o progresión de la enfermedad. En general, las personas nuevas en el campo del ácido nítrico tendrán dificultades porque muchos métodos no son lo suficientemente sensibles para detectar y cuantificar estos bajos niveles de metabolitos del ácido tricarboxílico presentes en muestras biológicas. En primer lugar, una técnica inadecuada durante el procesamiento de la muestra probablemente generará artefactos que conducirán a datos erróneos e interpretaciones incorrectas de los resultados.