Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

Este video demuestra un método en el que se utiliza luz UV para manipular la actividad de una proteína en la membrana plasmática. Para ello, las células se transfectan simultáneamente con la proteína FRB anclada a la membrana y la proteína de interés fusionada a FK BP. Se añade un derivado de rapamicina fotoencapsulada al medio.

Luego, durante la imagen de células vivas, se aplica luz UV a una región específica de la célula. El enlazador entre la rapamicina y la biotina se escinde, liberando el dimerizador químico y su subproducto; el dimerizador liberado difunde hacia el interior de las células e induce la dimerización entre la proteína de interés marcada con FKBP y la FRB anclada a la membrana plasmática en la región irradiada. Sin la radiación UV, FKBP y FRB no se asocian, por lo tanto no producen ningún efecto.

El análisis de los datos revela un reclutamiento altamente localizado de la proteína de interés fusionada con FKBP, basado en su efecto fisiológico. La ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los enfoques farmacológicos y genéticos, es la combinación de rapidez de acción, especificidad del blanco y resolución espacial. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer metastásico, que es consecuencia de la migración de células cancerosas.

Por lo tanto, la manipulación de la actividad de factores clave de migración puede revelar su mecanismo molecular preciso, lo cual es un requisito previo para su tratamiento y cura. El procedimiento demostrativo estará a cargo de Chris Paul Meyer, un estudiante de posgrado, y Bob de Rose, un técnico de mi laboratorio. Comience este protocolo combinando lo siguiente en un tubo estéril de microcentrífuga: plásmido, ADN, FRB anclado a la membrana marcado con fluorescencia, FKBP, TIA uno y agua desionizada; añada una microlitro de enzima HD al mezcla y vortexee.

Incube el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante la incubación, agregue 50 microlitros de poli-L-lisina a cada pocillo de una cámara de vidrio de ocho pocillos e incube durante un minuto para recubrir la superficie; luego aspire la solución y lave el centro de cada pocillo con 50 µL de agua desionizada. A continuación, se utiliza tripsina en células NIH 3T3 con una confluencia del 80 al 85 %.

Después de que las células se desprendan, agregue 10 mililitros de DMEM que contenga 10% FBS, transfiera 375 microlitros de la suspensión a un tubo estéril de 15 mililitros y centrifugue a 1.500 ×g durante tres minutos. Tras la centrifugación, aspire cuidadosamente el medio. Añada 750 microlitros de DMEM con 10% FVS y Resus.

Suspenda el precipitado mezclando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces con la pipeta. Finalmente, agregue la suspensión celular a la solución de transfección y, utilizando la punta de la pipeta para mezclar suavemente, añada 250 microlitros de la suspensión celular para transfección a cada pocillo de la cámara. Deslice e incube.

37 grados Celsius durante 15 a 18 horas. Para sintetizar la rapamicina encapsulada, aducto de biotina. Comience preparando una solución stock de un milimolar de CRB en DMSO en un tubo fuge estéril; en un tubo microcentrífugo separado de 1,5 mililitros, disuelva un miligramo de avadon en 250 microlitros de PBS.

A continuación, conjugar el grupo protector con la rapamicina. Añada 0,5 microlitros de la solución stock de CRB a AVID disuelto, mezclando mediante varias inversiones y luego incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para obtener la solución conjugada de CRB-AVID, excluya las moléculas pequeñas no unidas y purifique CRBA equilibrando una columna de exclusión por tamaño G-25 con 300 microlitros de PBS.

Repita cinco veces después de que la columna haya equilibrado. Aplique 125 microlitros de solución de CRBA sobre el lecho central de la columna. Luego, centrifugue la solución durante dos minutos a 800 G a temperatura ambiente y recoja el flujo que atraviesa en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros tras la transfección de las células.

Cambie el medio a DMEM sin FBS para privar de suero a las células e incube durante 12 horas. Después de la incubación, aspire suavemente el medio y agregue 250 microlitros de la solución de CRBA preparada de un micromolar. A continuación, para visualizar la dinámica de proteínas en células vivas, utilice un microscopio confocal de disco giratorio con iluminación UV para acoplar la óptica a una luz LED UV de 365 nanómetros.

Con luz de fluorescencia epi. Defina las coordenadas y el tamaño de un punto de iluminación utilizando una placa de vidrio recubierta con colorantes fluorescentes excitados por luz UV. Esto permite un ajuste fino del área que se irradiará.

Coloque el portaobjetos con cámara que contiene las células sobre la platina utilizando un objetivo de 100 x y fluorescencia epipolarizada. Enfoque las células y localice una célula. Para la adquisición de imágenes, comience a obtener imágenes de las células tras determinar los niveles de fondo del efecto fisiológico.

Aquí, se mide el ondulado de la membrana irradiando luz UV en un cuadrante elegido de la célula, se disuelve el compuesto liberado, así como el rapamicina original en DMSO y luego en PBS hasta una concentración final de 400 nanomolares. Añada 100 microlitros de la solución a la cámara de imagen para inducir efectos globales. Capture imágenes de fluorescencia cada 15 segundos durante 20 minutos para determinar si la activación localizada de RAC puede inducir la formación local de ondulaciones.

Las células NIH three T three fueron transfectadas con el activador de RAC marcado con YFP, FK bp, TIA one y LDR, que es un anclaje a la membrana. La irradiación localizada en FRB en el borde de la célula, indicada por el círculo amarillo, fue seguida por una iluminación global con una lámpara de mercurio durante un segundo a partir de los 1063 segundos. Como puede observarse aquí, casi no se presentó ondulación de la membrana al principio.

Sin embargo, tras la iluminación localizada, se observó ondulación espacialmente confinada tras la iluminación global y la adición de rapamicina, que provoca la translocación de FK bp TIA uno hacia la membrana plasmática. La célula mostró formación de ondulaciones generalizadas, lo que indica que la formación de ondulaciones locales observada previamente fue causada por la activación espacialmente confinada de rack. Para un análisis cuantitativo, las células diana se dividieron en cuatro cuadrantes y se determinó la frecuencia de formación de ondulaciones en cada cuadrante tras la estimulación local y tras la estimulación global, como se muestra en este gráfico.

Ninguna de las células observadas mostró formación de ruffles con CRBA sin irradiación UV o UV local, una irradiación con o sin Aden en medio masivo. Sin embargo, cuando se agregó CRBA y se realizó la irradiación UV, se observó formación de ruffles en aproximadamente el mismo porcentaje, alrededor del 90 % en todos los cuadrantes con irradiación global; cuando solo se irradió el cuadrante uno, la frecuencia de formación de ruffles fue del 100 % en comparación con 30 %, 25 % y 30 % en los cuadrantes dos a cuatro. Estos resultados indican que la desprotección localizada de rapamicina puede utilizarse para inducir efectos fisiológicos altamente localizados en una sola célula.

En este caso, el arrugamiento de la membrana causado por la activación de rack. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lograr un control espaciotemporal de la actividad de las proteínas pequeñas GTPasas mediante la luz. Este método podría aplicarse a cualquier proceso fisiológico que dependa de la translocación específica de proteínas hacia la membrana plasmática.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar siempre soluciones, reactivos y células frescos para cada ensayo. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas protectoras contra la UV.