Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

El objetivo general de este procedimiento es demostrar métodos para examinar los comportamientos sensoriomotores y de coordinación de Drosophila. Esto se logra evaluando primero la función motora de las larvas mediante el ensayo de arrastre, evaluando la función motora de los adultos mediante el ensayo del anillo y evaluando las habilidades de coordinación y sensoriales de los adultos con el ensayo de cortejo. En última instancia, este conjunto de ensayos conductuales puede mostrar cómo factores genéticos y externos, como tratamientos con fármacos, pueden influir en la actividad y la coordinación.

En intra sophala. La principal ventaja de este ensayo frente a métodos existentes como el eje geo negativo es que el ensayo de anillo tiene una mayor capacidad de procesamiento y es más sensible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como la detección en etapas tempranas de defectos locomotores.

Este ensayo será demostrado por la Dra. Jamie Becknell, posdoctorado en mi laboratorio. El ensayo de arrastre larval se utiliza para medir el efecto de factores genéticos y ambientales sobre la motilidad. Para comenzar, establezca un cruce de 10 a 15 machos y 10 a 15 hembras vírgenes en una botella estándar. Después de 24 horas, los adultos sanos habrán puesto suficientes huevos para poblar la botella, manteniendo esa población con una edad coincidente de 24 horas.

Retire los adultos a un frasco nuevo y repita el proceso. Incube ahora el frasco hasta observar larvas de tercer estadio en el medio del frasco. Añada 50 a 100 mililitros de sacarosa al 20 % y deje reposar durante 20 minutos.

Las larvas flotarán hacia la superficie; recójalas utilizando una pipeta serológica de 25 mililitros con la punta cortada y colóquelas en un cesto de malla. Lave las larvas en el cesto de malla dos veces con agua desionizada. Ahora pueden usarse en experimentos.

Para tratar las larvas con un fármaco, utilice un pincel para transportar el número deseado de larvas a un vaso de precipitados de cinco mililitros que contenga una solución de sacarosa al 5% y el fármaco de interés. Deje que se alimenten de la solución azucarada con fármaco durante 15 minutos, luego viértalas nuevamente a través de la cesta de malla, enjuáguelas y continúe con la medición del efecto del fármaco sobre la motilidad. Utilice un pincel para transportar una larva individual a una placa de Petri de 15 centímetros que contenga aros al 2%.

Coloque sobre una hoja de papel para calcar. Ahora recopile los datos. Simplemente cuente el número de líneas de la cuadrícula que cruza la lava en un minuto.

A continuación, utilice el pincel para transferir la larva al pocillo de una placa de disección de vidrio que contiene una solución diluida de pasta de levadura, bajo un microscopio estereoscópio, durante un período de un minuto, y cuente las contracciones de la larva. Se considera una contracción individual un movimiento completo desde el extremo posterior hasta el anterior. Repita el procedimiento hasta haber contado el número deseado de larvas.

El protocolo de anillo mide la velocidad locomotora de animales adultos: recolecte moscas macho adultas recién emergidas bajo anestesia ligera y transfiéralas a un frasco estándar que contenga alimento normal o con fármaco. Coloque aproximadamente 25 moscas por frasco. Mantenga las moscas a temperatura ambiente durante dos o tres días para una recuperación completa de la anestesia y la acumulación de niveles estables del fármaco.

Luego, transfiera aproximadamente 25 moscas sin anestesia a viales de poliestireno con tapones moldeados y ensamble los viales en un aparato de anillo, uno o más. Permita que las moscas descanse durante 15 a 20 minutos mientras alinea una cámara digital para fotografiar los viales desde una vista lateral; tenga listo un cronómetro y ajústelo a la duración deseada para el ensayo. Normalmente tres segundos para realizar el ensayo.

Sostenga el aparato de anillo con una mano sin molestar a las moscas y sostenga el temporizador de la cámara con la otra mano con precisión. Toque el aparato sobre la mesa tres veces para hacer caer a las moscas e inicie simultáneamente el temporizador de cuenta regresiva de la cámara. Repita el ensayo una vez por minuto hasta haber realizado cinco o seis pruebas.

Es fundamental no reutilizar los viales de ensayo de poliestireno después de haber obtenido los conjuntos iniciales de datos. Debido a que las nuevas moscas colocadas en viales usados no treparán en la misma medida que las moscas colocadas en viales nuevos. Para recopilar los datos, utilice un visor de imágenes para puntuar la altura media, trepado por los diferentes grupos.

Este ensayo requiere cruces genéticos preparados en frascos que estén produciendo abundante descendencia para recolectar moscas para el ensayo. A las pocas horas del amanecer subjetivo del animal, limpie los frascos para recolectar todos los adultos a intervalos de tres a cuatro horas. Recolecte machos y hembras recién emergidos y sexualmente ingenuos; mantenga los machos individualmente en viales o tubos con alimento, y a las hembras en grupos de cinco a seis.

En recintos similares, se requiere un número igual de machos y hembras para el ensayo. Después de aislar las moscas recolectadas durante cinco días, prepárese para colocarlas en una rueda de apareamiento y llevar a cabo el ensayo. A continuación, transfiera cuidadosamente una hembra y un macho a la cámara de una rueda de apareamiento bajo un microscopio de disección.

Observe a la pareja durante 10 minutos o hasta que copulen con éxito dentro de ese tiempo. Registre cuándo se observa por primera vez cada uno de varios comportamientos. Registre cuándo el macho se gira por primera vez hacia la hembra.

Cuando el macho toca por primera vez a la hembra con su pata, registre el momento; cuando el macho extiende y vibra por primera vez un ala, registre el momento; cuando el macho lame por primera vez las genitales de la hembra, registre el momento; cuando el macho encoge por primera vez su abdomen debajo de sí. Registre cuándo el macho intenta por primera vez montar a la hembra. Finalmente, registre el tiempo total dedicado al comportamiento de cortejo hasta que ocurra la cópula.

Para animales de tipo silvestre, esto ocurre casi siempre dentro de los cinco a diez minutos; recopile los datos mediante tres parámetros diferentes. Primero, la latencia de un comportamiento es el tiempo que transcurre antes de que este se observe por primera vez. Segundo, la frecuencia de un comportamiento indica si este se observa o no.

Y tercera, el índice de cortejo es el tiempo dedicado al cortejo dividido por el tiempo total hasta la cópula en un experimento con animales. Mutaciones en F-U-S-T-L-S relacionadas con esclerosis lateral amiotrófica. Mutantes del gen con una inserción central mostraron la mitad de la capacidad de desplazamiento de los controles de tipo silvestre a la izquierda, y una mutación de sentido equivocado R 5 21 C redujo la velocidad de desplazamiento a solo aproximadamente un centímetro por minuto.

La prueba de anillo en moscas adultas jóvenes de tipo silvestre arrojó una altura promedio de entre tres y cinco centímetros trepados en un período de tres segundos. En este ensayo, no se observó desensibilización durante hasta cinco pruebas consecutivas espaciadas un minuto entre sí mientras se realizaba la prueba de anillo. Es importante recordar ser lo más preciso posible en cuanto al tiempo.

Una vez dominado, el ensayo de aglomeración larval puede realizarse en 30 a 40 minutos para observar 10 ensayos de un genotipo si se lleva a cabo correctamente. Tras ver este video, también debería tener una buena comprensión de cómo observar y puntuar los comportamientos de cortejo en la mosca.