Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos
23 de agosto de 2012
Se presenta un enfoque de microfluidos para la expresión de matrices de proteínas. El dispositivo consiste en miles de cámaras de reacción controladas por micro-mecánicos válvulas. El dispositivo microfluídico está acoplado a una biblioteca de genes de microarrays-impreso. Estos genes se transcribe y se traduce en un chip, lo que resulta en una matriz de proteína listo para su uso experimental.
El objetivo general de este procedimiento es crear una matriz modular de proteínas que no requiera un paso de purificación, lo que la hace compatible con cualquier biblioteca de proteínas. Esto se logra primero generando genes sintéticos mediante PCR de ensamblaje. A continuación, los genes sintéticos se disponen en matrices sobre portaobjetos epoxi.
Para fabricar el dispositivo microfluídico, utilice PDMS con moldes de control y flujo de silicona. Luego, el dispositivo microfluídico se alinea con la matriz de ADN impresa. Finalmente, se hace fluir lisado de reticulocitos de conejo dentro del dispositivo microfluídico y se expresan las proteínas.
Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la expresión de miles de proteínas mediante etiquetado con anticuerpos fluorescentes. Existen varias ventajas al utilizar la técnica basada en microfluídica frente a métodos existentes, como los microarreglos de proteínas. Microarreglamos ADN y luego utilizamos cellis para sintetizar proteínas en el dispositivo.
Por lo tanto, no requerimos la purificación de proteínas y las proteínas nunca se secan. Permanecen frescas durante todo el experimento. La técnica microfluídica también proporciona una mayor sensibilidad. Para fabricar el dispositivo microfluídico, exponga los moldes de control y flujo de silicona al vapor de clorotrimetilsilano durante 10 minutos para favorecer la liberación del elastómero.
Después de los pasos de horneado, prepare una mezcla de elastómero a base de silicona y agente de curado en dos proporciones diferentes: cinco a uno y veinte a uno, para los moldes de control y de flujo, respectivamente. Vierta el PDMS en proporción cinco a uno sobre la capa de control. Desgasifique la capa de control y hornéela durante 30 minutos a 80 grados Celsius.
A continuación, aplique por centrifugado la mezcla de PDMS en proporción 20 a 1 sobre la capa de flujo a 2.600 RPM durante 60 segundos, y luego cúzala a 80 grados Celsius durante 30 minutos. Separe lentamente la capa de control del molde, teniendo cuidado de no desprender el patrón de SU-8. Luego, utilizando un escalpelo, corte el dispositivo alrededor de su perímetro y use una aguja roma para perforar orificios que permitan el acceso a los canales de control bajo un microscopio.
Alinee manualmente las capas de flujo y de control comenzando por la esquina superior izquierda y colocando la válvula de botón en la capa de control en el centro de la cámara de reacción. A continuación, alinee la primera fila y suelte suavemente la capa de control fila por fila. Asegúrese de que todas las válvulas de botón estén en el centro de las cámaras de reacción y de que las válvulas de dirección y entrada crucen los canales de flujo en la posición correcta.
Repita el proceso localmente hasta que todas las filas estén alineadas. Una vez completamente alineadas, libere cualquier tensión en el PDMS levantándolo cuidadosamente desde los lados y las esquinas. Luego, hornee el dispositivo durante dos horas a 80 grados Celsius después de hornearlo.
Corte alrededor del perímetro y retire el dispositivo de dos capas de los orificios del molde de flujo para acceder a los canales de flujo y generar constructos de ADN para el dispositivo. Realice una PCR para producir genes sintéticos compuestos por un promotor T siete, un sitio de unión al ribosoma, un marco de lectura abierta con diferentes etiquetas de epítopos en cada extremo y un terminador T siete. Para preparar los genes sintéticos para su distribución en matriz, prepare una mezcla de polietilenglicol y D-eritrosa dihidrato. Dispense dos microlitros por reacción en los pocillos de un 384.
Placa de pocillos. Añada los genes sintéticos a una placa de 384 pocillos. Luego añada agua destilada hasta un volumen final de 20 microlitros.
A continuación, utilizando un punto de microarreglo, una serie de genes sintéticos sobre sustratos de vidrio recubiertos con epoxi. Bajo un estereoscopio, alinee manualmente el dispositivo microfluídico con el arreglo genético, colocando el punto de ADN en el centro de las cámaras de ADN. Luego, alinee el resto de las filas.
Finalice con un ajuste fino de todo el dispositivo para aliviar cualquier tensión sobre el PDMS y asegurar que se una bien al microarreglo. Levántelo localmente. Finalmente, una el dispositivo a la portaobjetos mediante incubación durante la noche en una placa calefactora a 80 grados Celsius.
Los colorantes alimentarios se utilizan en esta sección con fines de visualización. Las válvulas en la capa de control son accionadas desde la computadora mediante LabVIEW. El script de LabVIEW controla una serie de válvulas microsolenoides a través de una caja de control electrónico.
La válvula de solenoide del manifold está conectada al aire comprimido, el cual controla el flujo de aire y la presión hacia las válvulas de control del dispositivo. Utilizando un tubo plástico flexible con un diámetro interno de 0,02 pulgadas y un pasador de acero inoxidable, conecte el dispositivo al manifold de las válvulas de solenoide. Llene los tubos con agua doblemente destilada e inserte el pasador en los orificios de acceso de la capa de control.
Asegúrese de que cada tubo esté conectado a su canal de control correspondiente. Para activar los canales de control, ejecute la aplicación LabVIEW, ajuste la presión de aire a cinco PSI y luego aplique la presión de aire activando la válvula desde el script de LabVIEW. Esto impulsará agua hacia los canales de control de PDMS para identificar posibles interferencias entre los canales de control de dispositivos defectuosos.
Llene primero las válvulas del sándwich y de la dirección. Dado que los canales de control y las válvulas están llenos de agua, cebre las válvulas para bloquear los canales de flujo situados debajo de ellas. Para ello, aumente primero la presión de aire a 15 PSI y luego, en el programa de vista de laboratorio, utilice un conjunto de interruptores de encendido y apagado conectados a válvulas solenoides individuales.
Active todos los válvulas activando todos los botones interruptores para asegurar que todas las válvulas estén abiertas. Conecta un tubo a una de las entradas de flujo, y con un flujo de cuatro a cinco PSI introduce aire en el dispositivo. Esto liberará cualquier válvula adherida al portaobjetos de vidrio.
El dispositivo ya está cebado y listo para fines de visualización. Se utiliza un colorante alimentario amarillo para visualizar los reactivos en esta sección y la solución incolora representa los hippies para facilitar la autoensamblaje de una matriz de proteínas sobre la superficie y prevenir la absorción no específica dentro del dispositivo microfluídico; modifique químicamente la superficie conectando primero un tubo nuevo con la solución requerida a uno de los canales de flujo del dispositivo. A continuación, conecte el extremo libre del tubo al manifold manual y abra el flujo de presión de aire.
Cargue 40 microlitros de BSA biotinilada en un tubo nuevo y pase aproximadamente la mitad a través del dispositivo durante 20 minutos. Utilice hipurato de 50 milimolar para lavar cualquier sustrato no reaccionado entre cada uno de los pasos. A continuación, pase 25 microlitros de estreptavidina durante 20 minutos.
Encima de la biotina, lave la BSA con HES durante cinco minutos para eliminar el exceso de superficie alrededor del botón, cierre la válvula del botón y haga fluir el resto de la BSA biotinilada, luego lave nuevamente con HEPES durante cinco minutos. Finalmente, para crear una matriz de etiqueta anti-His bajo el botón, abra la válvula del botón y haga fluir 30 microlitros de Penta-His biotinilado durante 20 minutos para generar una matriz de proteínas en el dispositivo. Abra las válvulas del cuello y haga fluir reticulocito de conejo.
Solución rápida de reacción acoplada de transcripción y traducción a través del dispositivo hacia la cámara de ADN. A continuación, cierre las válvulas tipo sándwich para separar cada gen de su entorno e incube el dispositivo en una placa calefactora durante 2,5 horas a 30 grados Celsius. Luego, marque el extremo terminal de las proteínas con la mezcla C del anticuerpo SI tres.
Finalmente, utilizando un escáner de microarreglos con un láser de 532 nanómetros y un filtro de emisión de 575 nanómetros, determine los niveles de proteína. Esta figura muestra los niveles variables de expresión proteica en un arreglo de proteínas.
Normalmente, el 20 % de una biblioteca génica no se expresa a niveles detectables. Los niveles de fondo se determinaron utilizando cámaras que no fueron impregnadas con ADN. Por lo tanto, las señales de las cámaras de proteínas correspondientes se deben a ruido o a absorción no específica de los anticuerpos marcadores.
Si se realiza correctamente, la verificación del dispositivo toma cuatro horas y el experimento con el chip toma cinco horas.
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Descripción general
Este estudio presenta un enfoque microfluídico para la expresión de matrices de proteínas, que utiliza un dispositivo con miles de cámaras de reacción controladas por válvulas micro-mecánicas. La integración de una biblioteca génica impresa en microarreglo permite la transcripción y traducción en el chip, lo que resulta en una matriz de proteínas lista para usar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microfluídica
- Expresión de proteínas
- Bibliotecas génicas
Antecedentes
- Las matrices de proteínas son esenciales para diversos ensayos biológicos.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren pasos de purificación, lo que limita la compatibilidad.
- Los dispositivos microfluídicos pueden agilizar el proceso de expresión de proteínas.
- La PCR de ensamblaje se utiliza para generar genes sintéticos destinados a ser dispuestos en matrices.
Objetivo del estudio
- Crear una matriz modular de proteínas sin pasos de purificación.
- Mejorar la compatibilidad con cualquier biblioteca de proteínas.
- Mejorar la eficiencia de la expresión proteica utilizando microfluidos.
Métodos Utilizados
- Generación de genes sintéticos mediante PCR de ensamblaje.
- Disposición de genes sintéticos en portaobjetos epoxi.
- Elaboración de un dispositivo microfluídico utilizando PDMS.
- Flujo de lisado de reticulocitos de conejo al dispositivo para la expresión de proteínas.
Resultados Principales
- Se creó con éxito un dispositivo microfluídico funcional.
- Las proteínas se expresaron en el chip sin necesidad de purificación.
- El método demostró compatibilidad con diversas bibliotecas de proteínas.
- Se lograron eficazmente la transcripción y la traducción en el chip.
Conclusiones
- Este enfoque microfluídico simplifica la creación de matrices de proteínas.
- Elimina la necesidad de purificación, mejorando la facilidad de uso.
- La técnica puede aplicarse a diversas bibliotecas de proteínas para investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma de expresión proteica microfluídica permite la generación de alto rendimiento de matrices de proteínas funcionales sin necesidad de purificación, abordando un cuello de botella clave en la validación de dianas y el cribado de interacciones. Al mantener las proteínas en un estado nativo y no desnaturalizado en el chip, el método posibilita la detección fiable de interacciones proteína-proteína, proteína-ADN y proteína-ARN. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al reducir los falsos negativos derivados de la pérdida o mal plegamiento de proteínas durante la purificación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la validación funcional de objetivos mediante la expresión de proteínas completas con plegamiento correcto y modificaciones postraduccionales adecuadas.
- Valor operativo: Elimina los pasos de purificación, reduciendo la pérdida de muestras y aumentando el rendimiento para el cribado de bibliotecas a gran escala.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al proporcionar datos cuantitativos de expresión para miles de variantes en paralelo.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera matrices de proteínas estandarizadas directamente a partir de plantillas de ADN, asegurando consistencia entre lotes para ensayos de interacción reproducibles.
- Valor operativo: Integra la disposición de genes y la expresión de proteínas en un único dispositivo microfluídico, minimizando el tiempo de manipulación manual y el riesgo de contaminación cruzada.
- Preparación para ensayos: Produce señales fluorescentes cuantificables compatibles con escáneres de microarreglos para la cartografía de interacciones de alta densidad.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la caracterización rápida de interacciones proteicas en objetivos relevantes para enfermedades identificados en estudios ómicos previos.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la detección de autoanticuerpos o eventos de unión terapéutica mediante el uso de muestras derivadas de pacientes en matrices de antígenos expresados.
- Reducción de Riesgos Preclínicos: Permite una evaluación temprana de la unión fuera del objetivo o de perfiles de reactividad cruzada antes de avanzar con los candidatos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la preparación de bibliotecas genéticas sintéticas hasta la selección de interacciones, permitiendo una transición fluida desde la identificación de dianas hasta la validación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la expresión de genes en matriz para evaluar la actividad funcional de proteínas sin sesgos de purificación.
- Selección: Ofrece matrices de proteínas estandarizadas y recién preparadas, listas para su uso inmediato en ensayos bioquímicos o de interacción biofísica.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia que permiten comparar niveles de expresión y afinidades de unión en miles de condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona variantes genéticas con resultados funcionales de proteínas, posibilitando su correlación con datos fenotípicos o clínicos.
- Reutilización Empresarial: La plataforma microfluídica puede reprogramarse con nuevas matrices de ADN, lo que permite campañas iterativas de selección en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al expresar proteínas en su estado nativo, reduciendo artefactos derivados de la purificación o desnaturalización.
- Valor operativo: Permite el procesamiento paralelo de miles de reacciones en un espacio reducido, mejorando la eficiencia de los reactivos y el rendimiento.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción al generar rápidamente datos de interacción para grandes bibliotecas de variantes.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en perfiles integrales de interacción y fidelidad de expresión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la fabricación de dispositivos microfluídicos, incluyendo el moldeado de PDMS y la alineación de capas.
- Depende del acceso a equipos de impresión de microarreglos para la generación de matrices de ADN y sistemas de control microfluídico (por ejemplo, LabVIEW con válvulas solenoides).
- Necesita protocolos estandarizados para la preparación de bibliotecas genéticas, incluyendo PCR de ensamblaje y etiquetado con epítopos para detección.
- Implica la optimización de tiempos de incubación y concentraciones de reactivos (por ejemplo, lisado de reticulocitos de conejo, reactivos biotinilados) para objetivos específicos de expresión proteica.
- Está limitado por la disponibilidad de instalaciones para la fabricación de dispositivos microfluídicos y la habilidad técnica necesaria para la alineación y unión precisa de capas.
