Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

El objetivo general de este procedimiento es descubrir nuevas interacciones proteicas extracelulares implicadas en procesos de reconocimiento celular, en particular proteínas receptoras integradas en la membrana. El enfoque AveXis está diseñado para sortear las afinidades de interacción muy débiles que caracterizan a esta clase de interacciones proteicas y el hecho de que las proteínas de membrana son difíciles de manipular bioquímicamente. Esto se logra primero mediante la compilación de una biblioteca de proteínas recombinantes de las regiones extracelulares de los receptores de superficie celular.

Esto se logra diseñando plásmidos de expresión para producir las regiones del dominio ecto de los receptores como fragmentos solubles, tanto como cebos monoméricos biotinilados como cebos pentaméricos marcados con enzimas. El segundo paso consiste en expresar y normalizar las proteínas para que estén listas para la detección de interacciones. Todas las proteínas se producen en células mamíferas para asegurar que se agreguen modificaciones postraduccionales como enlaces disulfuro, puentes de sulfuro y glicosilación.

Un paso crucial en el protocolo consiste en asegurar que las proteínas cebo y presa dentro de la biblioteca se normalicen todas a niveles umbral. Luego viene la parte emocionante: la detección de nuevas interacciones. Los Bates se distribuyen en pozos individuales de una placa de microplaca y luego se analizan en busca de interacciones utilizando el elogio.

Luego se realiza un paso de lavado. El paso final consiste en añadir el sustrato para la enzima con el fin de detectar cualquier captura de presa en las matrices de proteínas cebo. En última instancia, los resultados de una pantalla VEX pueden mostrar qué receptores de superficie celular son capaces de formar parejas de unión y, por lo tanto, podrían estar involucrados en los procesos de reconocimiento y comunicación entre células.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos populares de extracción de proteínas, como el sistema de dos híbridos en levadura o las purificaciones bioquímicas, es que está diseñada específicamente para detectar interacciones extracelulares entre proteínas. Es especialmente adecuada para descubrir nuevas interacciones entre proteínas receptoras ancladas a la membrana. Estas interacciones son difíciles de detectar mediante otras técnicas porque las proteínas de membrana son bioquímicamente difíciles de manipular y, por lo general, sus interacciones con los receptores complementarios son extremadamente débiles.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con cómo las células se reconocen y se comunican entre sí. A nivel molecular, puede utilizarse para responder preguntas relacionadas con procesos biológicos básicos, como qué proteínas receptoras presentes en la superficie de los óvulos y espermatozoides se combinan entre sí, o qué interacciones entre receptores y ligandos son responsables de comportamientos celulares como la fusión de miocitos o la formación de la cresta neural. El principal desafío de este enfoque consiste en compilar las bibliotecas de proteínas de cebo y presa dentro de las cuales se realizará la búsqueda de interacciones.

También es muy importante asegurarse de que las proteínas cebo y presa estén normalizadas dentro de los niveles umbral requeridos para el ensayo. Esto reduce la frecuencia de falsos negativos y falsos positivos. Tuve la idea inicial de este método durante mi doctorado, cuando intentaba identificar un compañero de unión para la proteína de superficie celular CD 200.

Esencialmente, estaba planteando la pregunta: ¿cuál es el patrón de unión para este receptor particular de la superficie celular? Incluso hoy en día, esta sigue siendo una pregunta técnicamente difícil de responder. En aquel momento, sin embargo, el genoma humano estaba próximo a completarse y me di cuenta de que, dado que ahora contábamos con una lista completa de todos los receptores de la superficie celular en el genoma, podíamos preguntar ahora dentro de este conjunto de proteínas receptoras cuáles pueden interactuar técnicamente.

Esta es una pregunta mucho más sencilla de responder, y AveXis fue el método que desarrollamos para responderla. Una vez que se ha establecido una biblioteca de vectores de expresión de cebo y de presa, prepárese para transfectarlos en células HEC 293E: comience sembrando las células el día anterior a la transfección a una densidad de 250.000 células por mililitro en 50 mililitros de medio freestyle 293 para asegurar una biotinilación eficiente. Suplemente el medio utilizado para producir las proteínas de cebo, no las proteínas de presa, con D-biotina. Con todas las placas preparadas, incube las células durante la noche en condiciones estándar.

Dado que la biotina tiene baja solubilidad y una disolución precisa, preferimos pesar la biotina adicional y luego añadirla al medio agitando vigorosamente al día siguiente. Transfecte 50 mililitros de células en cultivo con 25 microgramos del plásmido cebo o presa utilizando un reactivo de transfección adecuado para producir cebos biotinilados; realice una cotransfección del constructo cebo en una proporción de 10 a 1 junto con plásmidos que codifiquen una forma secretada de la proteína ELI, ligasa de biotina, por cada cosecha.

Los cultivos, cinco días posteriores a la transfección, se clarifican primero mediante centrifugación a 3000 veces la gravedad durante 20 minutos y segundo mediante filtración del sobrenadante S a través de un filtro de 0.22 micrones. Una de las características clave de AveXis es que, dado que las proteínas recombinantes son secretadas, pueden diluirse o concentrarse hasta alcanzar actividades dentro del umbral. Descubrimos que las proteínas recombinantes presentan una expresión variable hasta en cuatro órdenes de magnitud, por lo que el paso de normalización reduce la aparición de falsos positivos durante las etapas de cribado.

Para comenzar la normalización del cebo, es necesario eliminar la desbiotina no conjugada del medio mediante diálisis, ya que competirá con la proteína de cebo biotinilada por los sitios de unión a la estreptavidina. Comience asegurando el cebo dentro de un tubo de diálisis. Para garantizar una diálisis eficaz de las proteínas recombinantes, hemos encontrado que es importante proporcionar un área de superficie excesiva al tubo de diálisis. Normalmente, proporcionamos dos o tres veces más tubo del estrictamente necesario para el volumen que se va a dializar.

En un período de 24 horas, dialice extensamente el cebo contra un tampón adecuado, como PBS, tras realizar la diálisis. Comience un ELIZA bloqueando los pocillos de una microplaca codificada con estreptavidina con PBST que contiene BSA durante 15 minutos. Mientras tanto, en una placa limpia, realice una serie de cuatro diluciones uno a tres del cebo proteico en PBST con BSA al 2%.

Después de la incubación de 15 minutos, transfiera la dilución a la placa que codifica strep TTR e incube la placa durante una hora a temperatura ambiente. Pasada una hora, lave los pocillos y luego agregue a cada uno 100 microlitros de OX 68 a dos microgramos por mililitro. Incube la placa a temperatura ambiente durante otra hora. Después de la segunda incubación, realice otra serie de lavados y cargue la placa con anti-US fosfatasa alcalina.

Incube la placa durante una tercera hora a temperatura ambiente. Ahora lave la placa tres veces con PBST y realice un lavado final con PBS. Para eliminar cualquier resto de detergente, agregue 100 microlitros de sustrato de un miligramo por mililitro 1 0 4 en tampón de dietanolamina después de una hora.

A temperatura ambiente, mida la absorbancia a 405 nanómetros. Una serie de dilución de cuatro sobrenadantes de cebo dializados diferentes fue detectada por ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal antietiqueta CD4. Si las proteínas de cebo expresadas sin diluir no son suficientes para saturar todos los sitios de unión a biotina de una placa recubierta con estreptavidina, entonces concentre la proteína utilizando un concentrador Viva spin. De lo contrario, use la proteína de cebo a una concentración diluida en PBST con 2 % de BSA.

Esto es suficiente para saturar el sitio de unión a biotina del ensayo. Cuantifique los niveles relativos de expresión de las preproteínas utilizando la actividad de la enzima beta-lactamasa. Comience preparando una serie de diluciones del sobrenadante que contiene las paraproteínas en tampón PBST con 2 % de BSA.

Luego, agregue 20 microlitros de la dilución a 60 microlitros de una solución de nitroso estepina cargada en una placa. Transfiera inmediatamente la placa a un lector de placas y mida la absorbancia a 485 nanómetros una vez por minuto durante los siguientes 20 minutos utilizando concentradores centrífugos o dilución de PBST con 2 % de BSA. Ajuste la concentración final de las muestras para hidrolizar todos los nitrosos en el ensayo en aproximadamente siete minutos, lo que equivale a unas dos conversiones de nitrosos por minuto.

Comience la prueba AveXis lavando una placa recubierta con TAVR ENC de strep en PBST y sacudiendo la placa seca contra una toalla de papel. A continuación, agregue PBST con BSA a cada pocillo e incube la placa durante 30 minutos. Esto bloquea sitios espurios de unión a proteínas.

En cada uno, eliminaremos la solución bloqueante con un movimiento rápido del plato sobre el fregadero y añadiremos 100 microlitros de cebo biotinilado monomérico normalizado a los pozos correspondientes. Incube el plato durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire las muestras de cebo del plato con otro movimiento rápido y lávelas tres veces con PBST.

Luego, séquelo dando toques tras el tercer lavado. Ahora agregue 100 microlitros del constructo de presa pentamérico normalizado a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, realice tres lavados más con PBST y un lavado final solo con PBS.

Finalmente, agregue 60 microlitros de solución de nitrato siete a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante dos horas, o preferiblemente incube las placas durante 16 horas a cuatro grados SIU. Al día siguiente, las interacciones positivas habrán adquirido un color rojo. Tome una fotografía de la placa como registro visual y luego cuantifique las reacciones a una absorbancia de 485 nanómetros utilizando un lector de placas.

Alrededor de 10 minutos después del inicio de la reacción de cribado de AveXis, se observaron cambios de color de amarillo a rojo tanto en el control de captura de presas mediado por anticuerpos como en la interacción del control positivo. Este cambio de color indica la hidrólisis de los nitritos en el sustrato. Algunas interacciones positivas son observables en esta escala de tiempo, pero la mayoría tardaron algunas horas en aparecer.

Normalmente, se ha observado una tasa de aciertos de alrededor de 0,4 a 0,6 %positivos. Una vez que se preparan las bibliotecas de proteínas, la parte de cribado de esta técnica puede realizarse rápidamente. Es bastante posible cribar hasta 12 placas en un día tras identificar una interacción.

El siguiente paso más importante consiste primero en demostrar que la interacción puede repetirse utilizando preparaciones frescas e independientes de las proteínas. En segundo lugar, siempre determinamos si la interacción es independiente de la orientación entre el reclamo y el presa, es decir, si puede ser reciproca. Esto implica clonar los dominios del vector reclamo en el vector presa y viceversa.

Las interacciones que pueden repetirse y recíprocarse se consideran de alta confianza y siempre se han demostrado que son positivas. Utilizando otras técnicas como la resonancia de plasmón superficial, nos gusta usar la resonancia de plasmón superficial para validar adicionalmente cualquier interacción que volvamos a identificar. Es importante destacar que esto proporciona una demostración de que los dos componentes purificados pueden interactuar directamente y también puede utilizarse para mostrar que la unión es saturable y, por lo tanto, específica.