Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

El objetivo general de este procedimiento es lograr un seguimiento estandarizado del comportamiento in vivo de células madre trasplantadas en el cerebro de ratón. Esto se consigue primero marcando las células estromales derivadas de la médula ósea, que expresan simultáneamente EGFP y luciferasa, con partículas fluorescentes de óxido de hierro de tamaño micrométrico. El segundo paso consiste en inyectar adecuadamente las CMO marcadas con MPIO en el tejido cerebral del ratón.

A continuación, la supervivencia y la localización de los injertos celulares se siguen de forma no invasiva mediante imágenes de bioluminiscencia e imágenes por resonancia magnética. El paso final consiste en validar los resultados de las imágenes in vivo mediante análisis histológico post mortem. Este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de las células madre tras el trasplante en el cerebro de ratón, pero también puede aplicarse a otros sistemas, como organismos modelo y estudios de enfermedades.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de manipulación del animal son difíciles de aprender porque las inyecciones intravenosas e intracerebrales son complicadas de realizar y conllevan ciertos riesgos para la supervivencia del animal. Para comenzar este procedimiento, agregue 75 veces 10 a la seis partículas de óxido de hierro de tamaño micrométrico azul glaciar a un cultivo celular subconfluente en crecimiento. Incúbelas durante otras 16 horas para permitir la absorción de partículas mediante endocitosis, luego lave las partículas restantes.

Deje crecer las células durante 24 horas adicionales para obtener una confluencia celular y una distribución homogénea del G-B-M-P-I-O. A continuación, utilice microscopía de fluorescencia para validar visualmente la absorción de partículas calculando la proporción de células positivas para EGFP y G-B-M-P-I-O respecto al número total de células positivas para EGFP. A continuación, lave dos veces las células marcadas con G-B-M-P-I-O, BMSC luciferasa EGFP, con 10 mililitros.

Trate las células con tripsina EDTA y recójalas posteriormente. Luego lave las células y resuspenda en una concentración final de 133 veces 10 a la sexta células por mililitro en PBS. Finalmente, mantenga las células en hielo hasta el trasplante.

En este procedimiento, anestesie al ratón mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina a 80 miligramos por kilogramo y xilacina a 16 miligramos por kilogramo. Espere cinco minutos a que el ratón se duerma, luego afeite su cabeza para permitir manipulaciones estériles. A continuación, coloque al ratón en un marco estereotáxico y desinfecte la piel con alcohol.

A continuación, aplique una pomada en sus ojos para prevenir la deshidratación. Realice una incisión media en el cuero cabelludo para exponer el cráneo con el fin de localizar el hipocampo. Perfore un orificio en el cráneo a dos milímetros posteriores y dos milímetros laterales utilizando una fresa dental.

En este momento, agite brevemente la suspensión celular mediante vortex y luego aspire la suspensión celular en la jeringa. Posteriormente, introduzca la jeringa con aguja a una profundidad de 2,5 milímetros por debajo de la duramadre y permita la equilibración de presión durante un minuto. Tras un minuto, retire la aguja hasta una posición de dos milímetros por debajo de la duramadre.

Luego, inyecte tres microlitros de la suspensión celular utilizando una bomba de microinyección automatizada a una velocidad de 0,70 microlitros por minuto. Después de la inyección, espere cinco minutos adicionales para prevenir el retroflujo de la suspensión celular inyectada. A continuación, retire lentamente la aguja.

A continuación, desinfecte los bordes de la piel y luego suture la piel. Inyecte 300 microlitros de solución de cloruro de sodio al 0,9 % por vía subcutánea para prevenir la deshidratación. Al final, coloque al ratón bajo una lámpara de calor para permitir la recuperación de la anestesia y realizar la imagen bioluminiscente.

Anestesie el ratón con una mezcla de 3%iso, fluoruro y oxígeno. A continuación, coloque el ratón en el imagenador de fotones. Reduzca el nivel de anestesia ajustando el fluoruro de isoflurano al 1,5%. A continuación, inyecte d-luciferina por vía intravenosa a 150 miligramos por kilogramo de peso corporal.

Adquiera la imagen durante cinco minutos utilizando el software de fotovisión. Después, realice el procesamiento de la imagen utilizando el software M three vision y cuantifique la señal observada utilizando regiones de interés fijas. Para realizar la imagen por resonancia magnética, anestesie el ratón con 3 % de ISO fluorado en una mezcla de oxígeno y óxido nítrico.

Luego, coloque el ratón en el sujetador de un sistema de RM horizontal de 9,4 Tesla. Reduzca el nivel de anestesia ajustando el isoflurano al 1%. A continuación, aplique una pomada en los ojos del ratón para prevenir la deshidratación. Después, utilice una sonda rectal para monitorear la temperatura corporal.

Luego, coloque un sensor debajo del abdomen del ratón para monitorear la frecuencia respiratoria. Mantenga la frecuencia respiratoria en 110 más o menos 10 veces por minuto y mantenga la temperatura corporal constante dentro de un rango estrecho de 37 más o menos 0,5 grados Celsius. A continuación, coloque la bobina RF de superficie encima de la cabeza del ratón.

Coloque el ratón en el centro del imán. A continuación, abra ParaVision 5.1 y configure los parámetros de secuencia según el manuscrito adjunto. Luego, adquiera un conjunto de 10 imágenes coronales de eco de espín ponderadas en T2 para obtener información anatómica específica.

Imágenes ponderadas en gradiente eco con dos estrellas NT para estudiar la migración de células madre con una resolución en el plano de 70 micrómetros cuadrados. En este paso, sacrifique el ratón y extraiga el cerebro. Fije el tejido cerebral a temperatura ambiente en paraformaldehído al 4% en PBS durante dos horas.

Después de dos horas, deshidrate el tejido cerebral colocándolo en diferentes gradientes de sacarosa a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, congele el tejido cerebral utilizando nitrógeno líquido y almacene el tejido a menos 80 grados Celsius hasta el momento del corte, cuando esté listo.

Corte el tejido cerebral en secciones de 10 micrómetros de grosor utilizando un criostato. Posteriormente, examine bajo un microscopio de fluorescencia las secciones criostáticas sin teñir para detectar la fluorescencia azul de las partículas G-B-M-P-I-O y la fluorescencia verde de las células que expresan EGFP. Luego, examine las secciones criostáticas sin teñir para detectar la fluorescencia de fondo verde roja proveniente de las células inflamatorias.

El procedimiento descrito de marcado con MPIO azul glaciar da como resultado un marcado altamente eficiente de las células BMSC, luciferasa EGFP, lo cual puede validarse fácilmente mediante microscopía de fluorescencia. A continuación, tras el injerto de BMSC marcadas con G-B-M-P-I-O, células luciferasa EGFP en el SNC de ratones, la supervivencia del injerto celular puede monitorizarse mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo basadas en la actividad de la luciferasa. Adicionalmente, la localización exacta de las células injertadas puede monitorizarse mediante imágenes de resonancia magnética in vivo basadas en el contenido de hierro del MPIO azul glaciar.

Finalmente, el análisis histológico muestra la validación de los resultados obtenidos mediante imágenes de bioluminiscencia y resonancia magnética. La supervivencia estable se confirmó por una expresión estable de EGFP en el tiempo tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la imagen molecular exploraran eventos celulares y moleculares tras el trasplante de células madre en diferentes modelos animales de enfermedades neurodegenerativas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes moleculares, aplicando bioluminiscencia e imágenes por resonancia magnética, y validar adecuadamente los resultados in vivo mediante evaluación histológica post mortem.