El desarrollo de bronquiolitis obliterante en un modelo murino de trasplante de pulmón ortotópico

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo de bronquiolitis obliterante que refleje el trasplante pulmonar ortotópico. Esto se logra primero obteniendo el pulmón donante de un ratón C 57 BL 10. El segundo paso consiste en preparar la funda para el anastomosis de la bronquia, la arteria pulmonar y la vena.

A continuación, el pulmón donante preparado se trasplanta a un ratón receptor C cinco siete BL seis. El paso final consiste en observar al ratón trasplantado durante 21 o 28 días después del trasplante. Finalmente, se utiliza un análisis histológico para mostrar lesiones de bronquiolitis obliterante en el pulmón trasplantado.

La principal ventaja de este modelo en comparación con el modelo de trasplante heterotópico con espejo es que el modelo actual imita la condición humana. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las estructuras superiores en los ratones son muy delicadas y más susceptibles a lesiones debido a que tienen una masa apenas una décima parte de la del ratón. Coloque el ratón donante en una cámara de contención sellada e induzca la anestesia con 5% de isoflurano. A continuación, use el catéter intravenoso de calibre 20 para intubar al ratón o traquea, y luego colóquelo en un ventilador para roedores.

Mantenga la anestesia con 1 a 2% de isoflurano. Después de asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado por la falta de respuesta al movimiento brusco de la cola y al pellizco de los dedos del pie, colóquelo en posición supina y prepare el abdomen con alcohol al 70%. A continuación, corte la piel que recubre el abdomen con un par de tijeras y exponga la musculatura abdominal.

A continuación, realice una esternotomía lapar mediante una incisión media a través de la pared abdominal y luego corte transversalmente el esternón, mueva los intestinos hacia un lado y localice la vena cava inferior, que se encuentra justo debajo del hígado. Inyecte heparina a 100 microlitros por kilogramo en la VCI. A continuación, tire hacia abajo del ligamento falciforme del hígado y corte el diafragma a lo largo de la inserción ventral caudal hacia la columna vertebral.

Corte ambos lados de la pared torácica hasta el cuello para exponer la cavidad torácica. Corte bilateralmente la caja torácica protegiendo el pulmón y retire el timo. A continuación, corte la VCI intratorácica a nivel del diafragma.

Ahora localice el corazón y extirpe la orejuela auricular derecha. A continuación, realice una incisión transversal en la raíz del tronco de la arteria pulmonar y utilice la incisión para lavar los pulmones con dos mililitros de solución de Ringer lactato fría y 0,1 mililitros de heparina. Exponga la tráquea y luego córtela junto con el esófago.

Ahora detenga la ventilación en dos tercios de la inflación al final espiratorio. Extraiga el corazón en bloque largo y guárdelo en hielo. Coloque gasa sobre el pulmón extraído para protegerlo de la luz.

Haga una incisión en el ligamento pulmonar hasta la vena pulmonar o vp. Retire el esófago y la aorta para localizar el hilio. Localice la arteria pulmonar o ap, que se encuentra en la parte más craneal del hilio y en el bronquio principal adyacente.

Disecar cuidadosamente la arteria pulmonar separándola del bronquio. Ahora, elaborar una cánula de arteria pulmonar a partir de un catéter intravenoso de calibre 24 cortándolo a una longitud de 0,5 milímetros con una extensión de 0,7 milímetros. La superficie de la cánula es de fibra AB trenzada.

Con el fin de proporcionar una superficie para la anastomosis, prepare una funda para el bronquio utilizando un material similar al de la funda de la arteria pulmonar, pero usando un catéter de calibre 20 cortado a una longitud de un milímetro con una extensión de 0,7 milímetros. El tamaño de la funda de la vena pulmonar varía según el peso del ratón donante. Para ratones que pesan entre 24 y 27 gramos.

El tamaño del manguito es de 22 gauge con una longitud de 0.7 milímetros y una extensión de 0.7 milímetros para ratones que pesan entre 27 y 32 gramos. Las longitudes son iguales, pero se utiliza un catéter de 20 gauge. Ahora, inserte los manguitos en la lente distal de la arteria pulmonar, la vena pulmonar y el bronquio, asegurando cada uno con sutura de seda 9-0.

Después de que todos los manguitos hayan sido correctamente colocados, envuelva el pulmón donante preparado en gasa empapada con solución de Ringer lactato y colóquelo sobre hielo hasta el trasplante. Para preparar el ratón receptor, induzca anestesia y colóquelo en ventilación mecánica de la misma manera que se utilizó para el donante.

Afeite la pared torácica izquierda y prepare con alcohol al 70%. Comience realizando una incisión toracotómica en el tercer espacio intercostal izquierdo. Extienda la incisión dorsalmente, cerca de la columna vertebral.

Asegúrese de que el campo quirúrgico esté cubierto de manera estéril y coloque un clamp para microvasos sobre los vasos pulmonares y el bronquio izquierdos adyacentes al corazón. La arteria pulmonar puede visualizarse en la parte craneal, la vena pulmonar en el extremo caudal del hilio y el bronquio entre ambos. A continuación, ejerza tracción suave con una pinza hemostática para generar una tensión leve sobre la AP, la VP y el bronquio.

Mantenga las estructuras hiliares ocluidas y reseccione cuidadosamente el pulmón izquierdo. Aísle la arteria pulmonar, la vena pulmonar y el bronquio, y luego coloque una sutura de 0 alrededor de cada estructura de forma laxa. Diseque completamente la arteria pulmonar de su vaina adventicial y luego realice una pequeña incisión transversal de aproximadamente un cuarto de la circunferencia del vaso en la pared anterior.

Mientras se deja intacta la continuación de la parte dorsal de la arteria, obtenga el pulmón donante, que está envuelto en gasa de algodón fría empapada en solución de Ringer con lactato, y colóquelo en la cavidad torácica. A continuación, inserte las fundas en la arteria pulmonar, la vena pulmonar y el bronquio del receptor para crear la anastomosis y ligue estas con sutura nano. Luego, retire el pulmón del receptor.

A continuación, retire la pinza cruzada hilar, lo que permite la reperfusión y la ventilación. Coloque el pulmón trasplantado nuevamente en la caja torácica del receptor y cierre la incisión de toracotomía. Utilizando sutura de cinco oh, el ratón debe recuperarse ahora de la anestesia. Se puede administrar buprenorfina para aliviar el dolor después de que el ratón haya recuperado la conciencia.

Esta tabla muestra los puntajes histológicos de rechazo agudo y la prevalencia de bronquiolitis obliterante u OB. La puntuación post-trasplante del rechazo agudo se conoce como puntuación A. Las combinaciones de aloinjertos presentan una patología de rechazo agudo o crónico considerablemente mayor en comparación con el injerto ISO. Además, la prevalencia de bronquiolitis obliterante fue significativamente mayor en las combinaciones de aloinjertos que en el injerto ISO a los días 21 y 28 post-trasplante.

Los hallazgos macroscópicos e histopatológicos a los 28 días posteriores al trasplante pulmonar se muestran aquí. Estas imágenes representan hallazgos macroscópicos y pulmón injerto ISO teñido con H y E, así como pulmón derecho no tratado. Estas imágenes representan tinciones de h y e y tricrómica de Masen en injertos pulmonares alógenos BL 10 trasplantados en receptores murinos BL seis, que desarrollaron OB y no OB, respectivamente.

La flecha blanca en un B identifica las lesiones OB. Este panel muestra un trasplante de injerto pulmonar BL seis en un receptor murino BL 10 una vez dominado. Esta técnica puede realizarse en casi media hora si se realiza adecuadamente.

La utilidad de esta técnica radica en que puede utilizarse para responder preguntas mecanicistas sobre la disfunción primaria del injerto, el rechazo agudo y la bronquiolitis ablativa tras el trasplante pulmonar.