Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC

El objetivo general de este procedimiento es crear una matriz compuesta hecha de biomateriales naturales que pueda utilizarse para entregar y diferenciar células madre y así ayudar en la cicatrización de heridas. Esto se logra primero aislando células madre derivadas de tejido adiposo o una CMC de un animal de prueba. A continuación, las CMC se cargan sobre microesferas de quitosano previamente elaboradas.

Luego se vierte el gel de colágeno FIBRILADO y se colocan las perlas A-S-C-C-S-M sobre el gel de colágeno. Finalmente, se vierte el gel de fibrina PEG sobre el gel de colágeno A-S-C-C-S-M y se añade medio. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la migración simultánea bidireccional de A SC desde la perla CSM hacia las matrices de colágeno y fibrina PEG.

Mediante este procedimiento, una única fuente de células madre puede recibir señales diferenciales provenientes de los microentornos de colágeno y fibrina PEG, y ser estimulada de manera diferencial para producir factores pleiotrópicos y formar una red de estructuras prevasculares. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los compuestos de material único o los sustitutos de piel descelularizados es que estos otros productos no abordan activamente la revascularización del producto por parte del huésped. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que el RAD A SE aislado tiene la tendencia a diferenciarse hacia un fenotipo vascular cuando se cultiva en una matriz de fibrina porcina.

Esta observación generó la idea de que una única fuente de células madre podría utilizarse simultáneamente en un sistema que consistiera en diferentes biomateriales. Después de aislar y cultivar células madre derivadas del tejido adiposo o ASC, preparar microesferas de quitosano o CSM y cargar las ASC en las CSM, prepare un hidrogel de fibrina y polietilenglicol disolviendo el peg modificado con succinil glutarato en cuatro mililitros de solución salina tamponada con tris. Justo antes del experimento, utilice un filtro de 0,22 micrones para esterilizar la solución.

En un pocillo de cultivo de una placa de seis pocillos, mezcle 500 microlitros de solución stock de fibrinógeno y 250 microlitros de solución stock de PEG, e incube durante 20 minutos en un incubador humedecido con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. A continuación, mezcle 250 microlitros de A-S-C-C-S-M previamente preparado con la solución de fibrinógeno pegilado, agregue inmediatamente un mililitro de solución stock de trombina y, utilizando una pipeta, agite rápidamente una o dos veces; coloque inmediatamente la mezcla de gel celular en una placa de doce pocillos e incube en una cámara humedecida con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, lave dos veces el fibrinogel pegilado resultante con HBSS e incube con medio mínimo esencial alfa suplementado con 10 % de suero bovino fetal en un incubador humedecido con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius, utilizando técnicas estándar de microscopía de luz durante un período de 11 días.

Observe la migración de las células desde el CSM hacia la mezcla de gel, A-S-C-C-S-M, con colágeno tipo uno extraído de tendones de cola de rata utilizando dos hidróxidos de sodio normales. Ajuste el pH a 6,8 y fibrile. Añada el colágeno fibrilado, mezcla A-S-C-C-S-M, a una placa de 12 pocillos e incube en un incubador con 5% de dióxido de carbono humedecido a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Después de verificar que la fibrilación esté completa, incubar los geles de colágeno A-S-C-C-S-M hasta por 11 días en un incubador humedecido con dióxido de carbono al 5 % a 37 grados Celsius. Observar la migración de las células desde el CSM hacia el gel durante un período de 11 días utilizando técnicas estándar de microscopía para desarrollar el constructo bicapa y estudiar las propiedades migratorias y de coinducción de una única fuente de células madre. Utilizando dos andamios biológicos.

Prepare tanto los geles de colágeno como los de fibrina PEG con las siguientes modificaciones leves: prepare un mililitro de colágeno al 7,5 miligramos por mililitro. Luego transfiera la mezcla a un inserto de cultivo tisular de seis pocillos e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Tras la fibrilación completa, coloque sobre la superficie de colágeno 200 microlitros de cinco miligramos de A-S-C-C-S-M en medio de cultivo.

Después de que las microesferas se hayan sedimentado sobre el gel, prepare el gel de fibrina PEG utilizando 250 microlitros de medio de cultivo celular. Luego, superponga la solución de fibrinógeno pegilado y trombina sobre las capas de colágeno A-S-C-C-S-M. Una vez finalizado, incube los constructos durante 30 minutos en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono para lograr la formación completa del gel.

Finalmente, coloque un mililitro de medio en la cámara superior sobre el constructo y tres mililitros de medio en la cámara inferior. La caracterización de una SC integrada dentro de este andamiaje reveló que las CSM cargadas con SC pueden colocarse en forma de sándwich entre una capa de colágeno y otra de fibrina pegada, recibiendo simultánea y diferencialmente señales de ambos entornos extracelulares para prosperar en sus nuevas condiciones. Como se muestra aquí, el colágeno favoreció la capacidad de las ASC para mantenerse como células madre, tal como se demostró mediante su expresión de stro-1 en verde, así como por su morfología semejante a la de fibroblastos.

En contraste, el fibrinógeno PEG indujo a las ASC a diferenciarse hacia un fenotipo avascular, como se demuestra por su morfología similar a tubos que se observa aquí, completa con lumen, y su expresión específica de células endoteliales del factor de von Willebrand, mostrado aquí en rojo. Además, como se demuestra aquí, estos fenotipos observados parecieron ocurrir tempranamente en el cultivo y se mantuvieron durante 11 días. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre derivadas del tejido adiposo de rata, cargarlas en microesferas de quitosano e incorporarlas en un hidrogel bicapa utilizando biomateriales aprobados por la FDA.

No olvide que los biomateriales y células utilizados en este protocolo se derivan de animales y seres humanos y pueden ser extremadamente peligrosos si están contaminados con patógenos de su huésped. Siempre se deben tomar precauciones, como el equipo de protección personal y técnicas de cultivo celular asépticas, al realizar estos procedimientos.