Vídeo-oculografía en ratones
19 de julio de 2012
Vídeo-oculografía es un método muy cuantitativa para investigar el rendimiento motor ocular, así como el aprendizaje motor. A continuación, describimos la forma de medir vídeo-oculografía en ratones. La aplicación de esta técnica en normal, tratamiento farmacológico o ratones modificados genéticamente es una poderosa herramienta de investigación para explorar la fisiología subyacente de comportamientos motores.
El objetivo general de este procedimiento es realizar videonistagmografía en ratones. Esto se logra primero equipando al ratón con una construcción de pedestal en su cráneo, lo que permite la inmovilización de su cabeza en un sujetador especial para cabeza y cuerpo. El segundo paso consiste en colocar al ratón en el sistema de videonistagmografía y calibrar el sistema de seguimiento del pupilo por video.
A continuación, se registran los movimientos oculares mientras se activa el sistema oculomotor mediante un amplio repertorio de estímulos vestibulares y optocinéticos. El paso final consiste en analizar estos movimientos oculares. En última instancia, la videonistagmografía en ratones normales, tratados farmacológicamente o modificados genéticamente puede utilizarse para explorar la fisiología de los comportamientos motores.
Aunque este método puede proporcionar información sobre el sistema motor ocular, también puede aplicarse para estudiar enfermedades de origen cerebeloso, vestibular u ocular mediante el uso de ratones mutantes que imitan patologías humanas. Para comenzar este procedimiento, anestesie al ratón en una cámara de gas con una mezcla de isof, flúor y oxígeno. Luego, mantenga la anestesia administrando el gas a través de una máscara.
A continuación, utilice una almohadilla térmica y un sensor anal de temperatura para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 grados Celsius. Posteriormente, aplique el ungüento ocular para proteger los ojos de la desecación, afeite el pelo craneal dorsal y limpie el área quirúrgica. Después, realice una incisión en la línea media para exponer la superficie craneal dorsal del cráneo, y limpie y seque la superficie.
Luego, aplique una gota de ácido fosfórico de bgma sobre Lambda. Después de 15 segundos, retire el ataque químico, luego limpie la superficie craneal con solución salina y séquela nuevamente. Aplique una gota de opti bond prime sobre la parte superior de la superficie craneal atacada y aire.
Deje secar durante 30 segundos. A continuación, agregue una gota de adhesivo opti bond encima del opti bond prime. Polimerice con luz UV durante un minuto.
Después de eso, cubra la capa adhesiva con una capa delgada de composite charisma. El conector con orificio para tornillo magnético y los sitios de fijación quedan incrustados en el composite. Luego, cure el composite con luz UV.
De nuevo, si es necesario, aplique capas adicionales de composite y cúralas con luz. Permita que el ratón se recupere durante al menos tres días después de la cirugía. El siguiente paso consiste en colocar al ratón en el sujetador y fijar su cabeza al mismo con el imán y un tornillo; monte el sujetador de la cabeza y del cuerpo del ratón sobre una plataforma XY.
Utilizando la plataforma XY, coloque la cabeza del ratón sobre el centro del plato giratorio para que el ratón pueda moverse sobre los ejes de cabeceo Ya y alabeo. Luego, coloque su cabeza en el ángulo correcto de cabeceo ya y alabeo alineando el ojo mediante la imagen visual del ojo generada por el sistema de escaneo ocular. Ahora, el plato giratorio está conectado a un motor controlado por servomotor de corriente alterna.
La posición del plato giratorio se monitorea mediante un potenciómetro conectado al eje del plato giratorio. El plato giratorio está cubierto por una pantalla cilíndrica circundante con un patrón de puntos aleatorios, la cual también está equipada con un motor controlado por servomotor de corriente alterna. La posición de la pantalla cilíndrica se monitorea mediante un potenciómetro conectado a su eje.
La pantalla puede iluminarse con una luz halógena. El movimiento de la plataforma giratoria y de la pantalla que la rodea está controlado por una computadora conectada a una interfaz de entrada y salida. Las señales de posición de la plataforma giratoria y de la pantalla circundante se filtran mediante una frecuencia de corte de 20 hercios, se digitalizan a través de la interfaz de entrada y salida y se almacenan en esta computadora.
El ojo del ratón es iluminado por tres emisores de infrarrojos. Dos están fijos al plato giratorio, y el tercero está unido a la cámara. Este tercer emisor produce un reflejo corneal de referencia, que se utiliza durante el procedimiento de calibración y durante las grabaciones de los movimientos oculares.
Una cámara CCD de infrarrojos equipada con un objetivo zoom está sujeta a la plataforma giratoria y enfocada hacia la cabeza del ratón. En el centro de la plataforma giratoria. La cámara puede desbloquearse y moverse alrededor del eje de la plataforma exactamente 20 grados.
Durante el procedimiento de calibración, la señal de video es procesada por un sistema de seguimiento ocular, que puede rastrear la pupila y la reflexión corneal de referencia en las direcciones horizontal y vertical a una frecuencia de muestreo de 120 hercios. Luego, la posición de referencia corneal, la posición de la pupila y las señales del tamaño de la pupila se digitalizan mediante la interfaz de entrada y salida, y se almacenan en el mismo archivo que las señales de posición de la mesa y de la pantalla circundante para calibrar los movimientos oculares. Ajuste la posición de la cabeza del ratón con respecto a la cámara de manera que la imagen de video de la pupila se sitúe en el centro del monitor y la representación de la referencia corneal se ubique sobre la línea media vertical del ojo, directamente encima de la pupila.
A continuación, mueva la cámara varias veces en incrementos de 20 grados pico. Gire alrededor del eje vertical de la plataforma giratoria. Utilice las posiciones de la pupila rastreada y del reflejo corneal de referencia registradas en las posiciones extremas de la cámara para calcular el radio de rotación de la pupila.
Repita estos pasos varias veces bajo diversas condiciones de iluminación para determinar la relación entre el tamaño de la pupila y la rotación de la pupila. Luego, elabore una curva de corrección de la rotación pupilar. Ahora, calcule la posición angular del ojo midiendo la posición de referencia corneal, la posición pupilar y el tamaño de la pupila.
El valor de rotación de la pupila puede extraerse de la curva de corrección de rotación de la pupila y la posición angular del ojo puede calcularse utilizando la siguiente fórmula. Aquí se muestra el experimento de movimiento ocular VVOR. Ahora, convierta las posiciones oculares, las posiciones de la mesa y las posiciones de la pantalla circundante en posiciones angulares.
A continuación, diferencie y filtre las posiciones angulares de la mesa ocular y de la pantalla circundante con un filtro pasa-bajos de Butterworth. Utilizando una frecuencia de corte de 20 hertz sub, elimine el segundo de la señal de velocidad ocular mediante un umbral de detección de 40 grados por segundo. Luego, promedie las señales de velocidad de la mesa y del ojo utilizando cada ciclo individual del ensayo y ajuste las señales promediadas con una función adecuada.
En general, se utiliza una estimulación sinusoidal de velocidad y los ciclos promedio se ajustan con una función seno o coseno. Esta película muestra cómo los movimientos oculares son generados por la rotación de la pantalla circundante para provocar el reflejo optocinético, rotando la pantalla circundante en un rango de frecuencia de 0,2 a un hercio con una amplitud de 1,6 grados. Se muestra que el sistema optocinético del ratón es más eficiente en el rango de baja frecuencia que en el rango de alta frecuencia.
Aquí hay otra película que muestra cómo se generan los movimientos oculares. Al rotar el ratón en la oscuridad para provocar el reflejo oculovestibular, se gira la plataforma giratoria en un rango de frecuencia de 0,2 a un hertz con una amplitud de 1,6 grados. Se muestra que el sistema oculovestibular del ratón es más eficiente en el rango de alta frecuencia que en el rango de baja frecuencia.
Aquí se muestra otra película sobre cómo los movimientos oculares son generados al rotar al ratón en la luz para provocar un reflejo vestibulo-ocular visualmente potenciado, rotando la plataforma giratoria en un rango de frecuencia de 0,2 a un hercio con una amplitud de 1,6 grados, mientras que la pantalla circundante está bien iluminada, lo que demuestra que el ratón genera movimientos oculares compensatorios eficientes en todo el rango de frecuencia. Y esta película muestra cómo se logró el aprendizaje motor mediante el aumento adaptativo del reflejo vestibulo-ocular. Mediante un paradigma de entrenamiento fuera de fase, rotar la plataforma giratoria fuera de fase con respecto a la pantalla circundante incrementa la ganancia del RVO en este ratón.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un video ocul en ratones.
Resumen
Este artículo describe el procedimiento para realizar la video-oculografía en ratones, un método cuantitativo para investigar el rendimiento motor ocular y el aprendizaje motor. La técnica puede aplicarse a ratones normales, tratados farmacológicamente o modificados genéticamente para explorar la fisiología de los comportamientos motores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Rendimiento motor ocular
- Aprendizaje motor
Antecedentes
- La videooculografía es un método utilizado para estudiar los movimientos oculares.
- Esta técnica proporciona información sobre el sistema oculomotor.
- También puede utilizarse para estudiar enfermedades de origen cerebeloso o vestibular.
- Los modelos en ratón pueden imitar patologías humanas con fines de investigación.
Objetivo del estudio
- Medir y analizar los movimientos oculares en ratones.
- Investigar la fisiología subyacente de los comportamientos motores.
- Aplicar el método a diversos modelos de ratón para estudios de enfermedades.
Métodos Utilizados
- Equipar al ratón con un pedestal para la inmovilización de la cabeza.
- Calibrar el sistema de seguimiento del pupilo por video.
- Registrar los movimientos oculares utilizando estímulos vestibulares y ópticos.
- Analizar los movimientos oculares registrados para obtener información fisiológica.
Resultados principales
- Calibración exitosa del sistema de seguimiento ocular.
- Grabación de movimientos oculares bajo diversas condiciones de estímulos.
- Análisis de datos que revela conocimientos sobre la fisiología del comportamiento motor.
- Aplicación del método para estudiar enfermedades del sistema motor ocular.
Conclusiones
- La videooculografía es una herramienta poderosa para estudiar los movimientos oculares.
- Este método puede mejorar la comprensión del aprendizaje motor y el rendimiento.
- Tiene potencial para investigar enfermedades que afectan al sistema oculomotor.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La videooculografía en ratones proporciona una lectura conductual cuantitativa para evaluar la función oculomotora, permitiendo la reducción mecanicista de riesgos en dianas implicadas en las vías vestibular, cerebelosa y motora ocular. El método apoya la validación de dianas al vincular manipulaciones genéticas o farmacológicas con cambios medibles en los movimientos reflejos del ojo, ofreciendo una confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento. Su aplicabilidad a modelos relevantes para enfermedades mejora la continuidad traslacional en las líneas de investigación de trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas dirigidas a los sistemas vestibular, cerebeloso y oculomotor mediante fenotipos conductuales cuantificables.
- Valor operativo: Proporciona un ensayo reproducible y compatible con alta capacidad para la selección de modificadores genéticos y farmacológicos del comportamiento motor.
- Valor científico: Apoya la reducción de riesgos biológicos al aislar la función del circuito oculomotor de variables motoras o motivacionales que puedan interferir.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (velocidad ocular, ganancia, fase) que permiten la correlación dosis-respuesta y genotipo-fenotipo.
- Valor operativo: Los protocolos estandarizados de calibración y seguimiento garantizan la reproducibilidad entre laboratorios y la disponibilidad del ensayo para la evaluación de compuestos.
- Valor científico: Los resultados apoyan la reducción de riesgos mecanicistas al distinguir las contribuciones del control motor provenientes del sistema vestibular, del optocinético y del reflejo vestíbulo-ocular potenciado visualmente.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Sistema relevante para la enfermedad: los modelos murinos que imitan patologías vestibulares, cerebelosas u oculares humanas permiten una alineación directa de biomarcadores con traslación clínica.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal del aprendizaje motor y de la plasticidad adaptativa, apoyando la validación preclínica de terapias cognitivas y motoras.
- Valor científico: Facilita la toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación de la recuperación funcional o la progresión del déficit en modelos genéticos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano como una herramienta de cribado fenotípico para la validación de dianas, cuyos resultados informan las decisiones de identificación de compuestos activos y de avance preclínico basadas en la integridad del sistema oculomotor.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al aislar las contribuciones vestibular y optocinética al control del movimiento ocular.
- Selección: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante fijación estandarizada de la cabeza, calibración y presentación de estímulos, lo que permite la evaluación fiable de compuestos o genotipos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas (posición angular del ojo, velocidad, ganancia) filtradas y ajustadas a estímulos sinusoidales para análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la aplicabilidad en modelos de enfermedad, permitiendo la evaluación del impacto terapéutico sobre los fenotipos del comportamiento motor.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para equipos multidisciplinarios que estudian el aprendizaje motor, los trastornos del equilibrio y las indicaciones neuropsiquiátricas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Confianza predictiva en la interacción con el blanco mediante cambios medibles en la ganancia y la fase del RVO, ROK y RVOV.
- Valor Operativo: La preparación quirúrg游戏副本ica estandarizada, la inmovilización de la cabeza y el seguimiento por infrarrojos garantizan la reproducibilidad entre laboratorios y puntos temporales.
- Valor Estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases avanzadas al permitir la detección temprana de disfunciones en circuitos motores en modelos genéticos o farmacológicos.
- Impacto en el Portafolio: Informa decisiones de continuar/descartar proyectos al cuantificar el desempeño oculomotor como biomarcador de la integridad de los circuitos neuronales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía murina, implante de placas craneales y sistemas de seguimiento oculomotor por infrarrojos.
- Depende de equipos especializados, incluidos plataformas XY, mesas giratorias controladas por servomecanismos, emisores de infrarrojos y cámaras CCD de alta velocidad.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos quirúrgicos, los procedimientos de calibración y los parámetros de estímulo para obtener resultados reproducibles.
- Las consideraciones de adaptación incluyen ajustes específicos del modelo según la cepa, el peso y la pigmentación ocular del ratón, factores que afectan la precisión del seguimiento por infrarrojos.
- Las limitaciones prácticas incluyen el tiempo de recuperación postquirúrgico y posibles factores de confusión derivados de la anestesia o la inflamación que afecten la función oculomotora basal.
