Controlar el tamaño, forma y estabilidad de los polímeros supramoleculares en el agua

El objetivo general del siguiente experimento es controlar el tamaño, la forma y la estabilidad de nanopartículas dinámicas supramoleculares en agua. Esto se logra mediante el diseño de amplificadores dicróticos que se autoensamblan o polimerizan, cuya estructura molecular está diseñada para presentar interacciones atractivas y repulsivas. Esto da lugar a un mecanismo de crecimiento frustrado que produce nanopartículas autoensambladas en agua con una forma esférica controlada.

Como segundo paso, se incrementa la concentración de sal en la solución acuosa, lo que debilita las interacciones repulsivas codificadas en la estructura molecular del disco anfifílico. Esto induce una transición de esfera a varilla; se realizan investigaciones espectroscópicas de dicromismo circular dependientes de la temperatura, o CD, para revelar los mecanismos subyacentes a esta transición de esfera a varilla. Además, se utiliza una combinación de técnicas analíticas, como microscopía electrónica de transmisión criogénica y resonancia magnética nuclear, para medir y visualizar la transición de un tipo de agregado a otro. Los resultados obtenidos muestran que la transición de esfera a varilla se manifiesta en una mayor cooperatividad en la polimerización supramolecular.

Esto se origina en una transición desde un proceso anti cooperativo en nanopartículas de tamaño restringido hacia un mecanismo completamente cooperativo de nucleación y elongación que, en este caso, conduce a polímeros supramoleculares muy grandes, es decir, nano barras dinámicas. La principal ventaja de combinar técnicas espectroscópicas como la espectroscopía de dicroísmo circular, dispersión de rayos X de pequeño ángulo y RMN con técnicas microscópicas como la criomicroscopía electrónica es que permite medir y visualizar transiciones de polímeros supramoleculares en agua. Estos polímeros dinámicos pueden responder a estímulos externos como cambios en la temperatura, cambios en la fuerza iónica o cambios en el pH.

La combinación de estos métodos es ampliamente aplicable y puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química molecular y los nanomateriales autoensamblados. Por ejemplo, se puede investigar la correlación entre las dimensiones de los agregados formados por el autoensamblaje de bloques moleculares pequeños y los mecanismos subyacentes de formación. Las implicaciones de esta metodología se extienden a una amplia gama de aplicaciones nanotecnológicas en biotecnología.

Estamos particularmente interesados en el área de la imagen biomédica y en el desarrollo de agentes de contraste nano-particulados autoensamblados, donde un equilibrio delicado entre la estabilidad del agregado, el alto contraste y la capacidad de excretar los agentes de contraste autoensamblados es de suma importancia para su éxito en uso clínico. Tuvimos inicialmente la idea de combinar técnicas de caracterización cuando nos dimos cuenta de que cambios sutiles en la estructura molecular de los bloques constitutivos autoensamblables pueden provocar diferencias fundamentales en el mecanismo de polimerización supramolecular. El procedimiento será demostrado por Paul Beaumont, quien es el experto y responsable de las instalaciones de criomicroscopía 10 en la Universidad Técnica de Trovan.

Comience este protocolo preparando una solución de DTPA de gadolinio BTA en un tampón de citrato 100 milimolar, como se describe en el protocolo escrito. Junto con este video, llene una cubeta UV Q de un centímetro con la solución. Inserte la cubeta en el soporte de cubeta del espectrómetro circular D crowism.

Mida un espectro de CD desde 230 hasta 350 nanómetros. Luego, mida una curva de enfriamiento de CD en la banda de CD de mayor intensidad desde 363 hasta 283 kelvin a una velocidad de un kelvin por minuto. A continuación, agregue el mismo volumen de solución tampón de cloruro de sodio dos molar a la solución tampón de citrato de BTA-DTPA de gadolinio.

Esto aumentará la fuerza iónica a un molar de cloruro de sodio y diluirá los discos a la mitad de la concentración. Vortexee la solución con la fuerza iónica incrementada durante 40 segundos tras el aumento de la fuerza iónica, y vuelva a medir un espectro de CD desde 230 hasta 350 nanómetros. Luego, mida una curva de enfriamiento de CD en la banda de CD de mayor intensidad desde 363 hasta 283 kelvin a una velocidad de un kelvin por minuto.

Exporte los datos crudos de CD a Origin 8.5. Normalice los espectros definiendo el efecto de CD a la temperatura más alta medida como igual a cero, y el efecto de CD a la temperatura más baja medida como igual a uno, ya que la magnitud del efecto de CD es proporcional al grado de agregación; por lo tanto, las curvas de CD normalizadas son proporcionales al grado de agregación. Los datos normalizados se ajustan utilizando la opción de ajuste de curva no lineal en Origin Pro 8.5 con un modelo de autoensamblaje dependiente de la temperatura.

En este modelo, se distinguen un régimen de nucleación y un régimen de elongación. Primero, ajuste el grado de agregación en el régimen de elongación. En esta ecuación, T representa la temperatura variable.

PHI N es la helicidad neta, que es proporcional al grado de agregación, y HE es la entalpía molecular de elongación. T TE representa la temperatura de elongación, que es la temperatura a la cual el autoensamblaje comienza a ser termodinámicamente favorable. El factor de normalización fiat se introduce para asegurar que Phi N dividido por fiat no exceda la unidad, lo cual se deriva de la restricción de que el grado de agregación no puede excederse.

El ajuste de unicidad permite extraer la entalpía de elongación en julios por mol y la temperatura de elongación en kelvin que caracteriza el autoensamblaje de las moléculas para una concentración dada. Al realizar el ajuste, debe obedecerse la restricción de que únicamente se debe ajustar el grado de agregación a temperaturas por debajo de TE, ya que la ecuación solo es válida en el régimen de elongación. Después de ajustar la primera ecuación, el único parámetro desconocido en la ecuación del régimen de nucleación es la constante de activación ka, que describe la cooperatividad de la polimerización supramolecular. Para hallar la constante de activación, ajuste el grado de agregación determinado experimentalmente a temperaturas superiores a TE en el régimen de nucleación.

Comience preparando las soluciones para microscopía electrónica según se describe en el texto. Prepare brevemente dos tampones: un tampón de citrato de 100 milimolares y un tampón de citrato de 100 milimolares con cinco molares de cloruro de sodio. Disuelva BTA de gadolinio DTPA en 0,1 mililitros de cada uno de los tampones preparados para obtener una concentración final de un milimolar. A continuación, trate con plasma una rejilla de cuantifoil recubierta con carbono utilizando un aparato C Resington 2 0 8 carbon coer que funcione a cinco miliamperios durante 40 segundos.

El procedimiento de vitrificación es una etapa crucial de la criomicroscopía, ya que asegura que una capa delgada de ISIS brillante producida sea adecuada para el análisis mediante TAM. La solución acuosa se aplica sobre la rejilla durante la vitrificación en un vitrobot automatizado FEI. Esto implica la aplicación de la muestra sobre la rejilla, la eliminación por absorción del líquido en exceso para crear una película delgada de la solución acuosa sobre la rejilla y la posterior vitrificación mediante inmersión rápida de la rejilla en etano líquido.

Después de la vitrificación, transfiera la rejilla tratada al nitrógeno líquido para preservarla, luego transfiera manualmente la rejilla de muestra a un casete de autocalentador, que también se enfría con nitrógeno líquido. El siguiente paso es insertar el casete en el cargador automático TUE Cryo Titan, TEM. El TUE Cryo Titan está equipado con una pistola de emisión de campo que opera a 300 kilovoltios.

La grabación de las imágenes TAM requiere experiencia y manejo rápido. Esto se debe a que el haz de electrones de alta energía daña la muestra durante la obtención de imágenes. Registre las imágenes utilizando una cámara CCD equipada con un filtro de energía de puerta posterior en la columna. Dado que el gadolinio es altamente paramagnético y las señales de protones se ensancharían significativamente, se utilizó un disco diferente en el que el gadolinio fue sustituido por itrio diamagnético y una solución de atrio de BT.

Se prepara el DTPA. Calcule cuántos miligramos de DTPA de BT atrio con un peso molecular de 2.979 gramos por mol son necesarios para alcanzar una concentración objetivo de un milimolar. Proceda a disolver la cantidad determinada de DTPA de BT atrio en tampón succinato desuterado 50 milimolar en D₂O tras pipetear 0,6 mililitros de la solución resultante en un tubo NMR de LABAs, un wilm.

Introduzca la muestra en una unidad variante del espectrómetro Nova 500 equipado con una sonda I-D-P-F-G de cinco milímetros de Varian. Realice los experimentos DOI según se describe en el texto, tras registrar un NMR estándar de protón adaptando el pulso de 90 grados y optimizando los tiempos de mezcla en consecuencia. Se utiliza la secuencia de pulsos DOI de una sola vez tras determinar la autodifusión de HDO en la sonda de referencia ovárica, y en la muestra se determina el coeficiente de difusión de los agregados, a partir del cual puede calcularse el radio hidrodinámico.

Finalmente, calcule los radios hidrodinámicos RH de los agregados utilizando la relación de Stokes-Einstein para la difusión de una partícula esférica. El carácter iónico de los complejos periféricos de gadolinio DTPA introduce frustración en el crecimiento unidimensional de los monómeros en forma de disco, cuyo núcleo está diseñado para polimerizar en agregados alargados con forma de varilla. El equilibrio entre las interacciones atractivas y repulsivas controla el tamaño y la forma de los agregados.

Una técnica poderosa para determinar el tamaño y la forma de partículas y soluciones es la fuente de sincrotrón. Dispersión de rayos X de pequeño ángulo o sucks. El BTA de gadolinio DTPA se disolvió en una solución de tampón citrato y los perfiles de sucks se registraron a dos concentraciones diferentes.

Una pendiente que se aproxima a cero en la región de bajo Q indica ausencia de forma y anisotropía en el agregado, lo que sugiere la presencia de objetos esféricos. Los datos medidos a diferentes concentraciones se ajustaron utilizando un factor de forma esférico homogéneo y monodisperso, lo que dio como resultado un radio calculado de 3,2 nanómetros. El radio geométrico calculado del disco monomérico, BTA de gadolinio DTPA, es de 3,0 nanómetros, lo cual, junto con la presencia de agregados con una relación de aspecto cercana a uno, proporciona evidencia adicional sobre la forma esférica y el tamaño en nanómetros de los objetos autoensamblados.

Se realizó espectroscopía NMR ordenada por difusión de protones. El NMR de DO permite determinar los coeficientes de difusión de los agregados supramoleculares, a partir de los cuales se puede calcular su radio hidrodinámico. El coeficiente de difusión del agregado diamagnético dicrótico en un tampón de succinato deuterado se determinó que era 0,69 veces 10 a la potencia menos 10 metros cuadrados por segundo mediante la relación de Stokes-Einstein.

Se calculó un radio hidrodinámico de 2,9 nanómetros para los objetos discretos de tamaño esférico. Este tamaño está en excelente acuerdo con el valor obtenido a partir de los datos de SOX para el gadolinio BTA-DTPA. Se obtuvo más evidencia del control exitoso sobre la longitud de la pila unidimensional a partir de micrografías de microscopía electrónica criogénica (cryo TEM).

El gadolinio BTA DTPA produce los objetos esféricos esperados con diámetros cercanos a seis nanómetros a una concentración de un milimolar, lo que confirma los resultados de las mediciones de so y DOI. La formación de polímeros supramoleculares en forma de varilla con alta relación de aspecto se observa claramente en micrografías de criomicroscopía electrónica a alta fuerza iónica. La pantalla electrostática es la explicación más probable para este hallazgo.

La forma cambia de un agregado esférico de aproximadamente seis nanómetros de diámetro a barras alargadas con un diámetro de seis nanómetros y una longitud de hasta varios cientos de nanómetros. Aquí se muestran los espectros de CD a temperatura ambiente del BTA de gadolinio DTPA con concentraciones crecientes de sal. La concentración del BTA de gadolinio DTPA es de ocho por 10 a la potencia menos tres milimolar a baja fuerza iónica y de cuatro por 10 a la potencia menos tres milimolar a alta fuerza iónica.

Aunque se aplica una concentración significativamente más baja para las mediciones de CD, el efecto algodón claro indica la presencia de agregados intactos incluso a concentraciones micromolares. La forma del espectro de CD cambia al aumentar la concentración de sal, lo cual es una buena indicación de interacciones repulsivas reducidas en la periferia de las pilas y un empaquetamiento mejorado de los decos. Además, las curvas de enfriamiento de CD de las mismas soluciones muestran diferencias notables en su forma.

La temperatura a la que comienza la agregación se desplaza hacia temperaturas más altas al aumentar la concentración de sal. También se hace evidente un mecanismo cada vez más cooperativo, caracterizado por un aumento más abrupto del efecto de CD, mientras que la curva de enfriamiento en ausencia de cloruro de sodio se describe mejor mediante un modelo ISO de autoensamblaje, indicativo de un proceso anti-cooperativo. La curva de enfriamiento a 1,0 molar de cloruro de sodio es típica de un proceso de autoensamblaje cooperativo y puede describirse mediante un modelo de nucleación-elongación que cuantifica los parámetros termodinámicos del autoensamblaje de BTA gadolinio DTPA a cero y un molar de cloruro de sodio.

El uso de un modelo cooperativo revela claramente la disminución de ka, que es la constante adimensional de activación. Valores más bajos de KA indican un mayor grado de cooperatividad en el proceso de autoensamblaje, lo cual se manifiesta en la formación de polímeros supramoleculares altamente alargados. Como se observa en microscopía electrónica criogénica, al intentar las técnicas experimentales demostradas, es importante recordar que solo una combinación de métodos experimentales conducirá a una descripción general significativa de los nanomateriales dinámicos bajo estudio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de qué tan ampliamente aplicable es nuestro enfoque experimental combinado y cómo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los nanomateriales autoensamblados y los superpoemas.