La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido

El objetivo general del siguiente experimento consiste en colocar una población de células madre sanas adyacentes a un tejido con células madre ablacionadas dentro de un parásito, con el fin de analizar in vivo el comportamiento de las células madre y sus descendientes durante la regeneración. Esto se logra anestesiando e inmovilizando ya sea un parásito no irradiado o un parásito irradiado por rayos X, para su posterior manipulación. A continuación, el parásito no irradiado e inmovilizado se protege parcialmente con plomo y luego se irradia con rayos X, lo que produce un parásito no lesionado con tejido de células madre ablacionadas adyacente al tejido protegido, que permanece cargado de células madre.

Alternativamente, puede trasplantarse un injerto de tejido obtenido de un donante no irradiado a un huésped previamente irradiado con el fin de generar un parabionte con una población aislada de células madre. Fally presente dentro de un huésped que, de otro modo, carece de células madre. Los resultados obtenidos muestran poblaciones aisladas de células madre adyacentes a los tejidos carentes de células madre mediante hibridación in situ de ARN en preparaciones completas para genes marcadores de células madre.

Por lo tanto, los métodos descritos aquí tienen como objetivo comprender mejor la regeneración en planarias mediante el estudio del comportamiento de las células madre tanto en un paradigma de trasplante como en un paradigma de irradiación parcial, lo que nos permite probar si los tejidos circundantes y los entornos locales en los que residen estas células madre afectan o no el comportamiento de estos neoblastos o células madre. Durante el proceso de regeneración, uno o dos meses antes del experimento, alimente las planarias según lo indicado en el manuscrito adjunto. Para obtener el tamaño deseado en esta demostración, se seleccionan planarias de entre uno y dos centímetros de longitud y más anchas que dos milímetros.

Luego, se les priva de alimento durante tres a siete días antes de su uso. A continuación, prepare la solución de clorotono, un anestésico local suave, disolviendo del 0,1 al 0,2 % peso por volumen de cleona en agua pariana. Enfrié luego la solución en hielo para el trasplante de tejido; con un mechero Bunsen, doble un tubo capilar de 0,75 milímetros de diámetro interno a uno o dos centímetros del extremo formando un ángulo de 90 grados para cortar el tejido de injerto.

Luego, doble otro tubo capilar con un diámetro exterior de 0,7 milímetros a una distancia de uno a dos centímetros del extremo formando un ángulo de 90 grados para crear un orificio en el huésped que reciba el injerto. A continuación, corte el papel filtro negro Watman. Papel filtro Kimwipe y papel para liar cigarrillos número tres según los tamaños indicados en el manuscrito adjunto.

Después de eso, prepare la solución modificada de Holt Fers y la solución saturada de Caine de Holt Fretter. Enfríe ambas a cuatro grados Celsius. Luego, sujete una toallita Kim doblada a un cuadrado de Paraform.

Colóquelo sobre la placa del enfriador Peltier u otro dispositivo de enfriamiento bajo un microscopio estereoscópico. Posteriormente, sature la toalla de papel Kim con solución fría de Holt Fretter. Luego coloque dos rectángulos de papel filtro negro sobre la toalla de papel Kim.

Ahora coloque un trozo de papel de filtro Watman número dos en una placa de Petri. Humedezca el papel de filtro con solución de Holt Fretter. Luego enfríe la placa sobre hielo para la irradiación parcial.

Coloque un forro de papel más grande en un recipiente más grande, de forma similar al trasplante de tejidos. Humedezca el papel filtro con la solución de Holt Fretter. Luego, enfríe el recipiente en hielo.

En este procedimiento, llene una placa de Petri con solución de cleona fría. Pipetee las planarias hacia el recipiente para trasplante. Anestesie solo un huésped y un donante a la vez.

Para la irradiación parcial, muchos animales pueden anestesiarse al mismo tiempo. Luego, deje que los paria se empapen en la solución de cleona durante cinco a 10 minutos hasta que queden inmóviles. Enjuague los paria pipeteándolos hacia un recipiente lleno con solución Holt Fretter fría.

A continuación, inmovilice el área de plin pipeteándola sobre papeles filtro negros saturados con solución fría de Holt fretter. Luego, oriente las muestras con la cara ventral hacia abajo utilizando un par de pinzas. Ahora coloque una placa de Petri previamente enfriada en un recipiente con hielo, el cual debe caber dentro de un irradiador de rayos X de fuente superior.

Organice el área de plin anestesiado en una placa de Petri moviendo los papeles de filtro negros. Luego transfiéralos a la fuente superior del irradiador de rayos X; coloque el recipiente con hielo de manera que se minimice la distancia desde el tubo catódico hasta la paria. Así se maximiza la tasa de dosis efectiva.

Luego, coloque los escudos de plomo entre el paria y el tubo catódico para la dosis de rayos X. Si se desea una ablación completa de células madre a partir de regiones no protegidas, administre 30 grays o más. Inmediatamente después de la emisión de rayos X, transfiera el paria a agua de paria fría.

Después de eso, permita que el agua de parian alcance la temperatura ambiente y que los animales se desprendan del papel de filtro negro. El procedimiento de irradiación parcial ahora ha finalizado. Para comenzar este procedimiento bajo el microscopio estereoscópico, coloque el huésped y el donante anestesiados en áreas separadas sobre filtros negros rectangulares colocados en la toalla de papel Kim, que ya ha sido enfriada en la placa Peltier o placa refrigerante.

Utilice un tubo capilar con un diámetro interno de 0.75 milímetros para extraer el injerto del donante. Luego, use un par de pinzas para colocarlo en una zona apartada del huésped. A continuación, utilice un tubo capilar con un diámetro externo de 0.7 milímetros para retirar un cilindro del huésped.

Posteriormente, coloque el injerto en el orificio. Transfiera el huésped trasplantado sobre el papel filtro negro rectangular al recipiente de Petri preparado previamente. Humedezca un trozo de papel de enrollar con solución de Holt Fretter saturada con Caine.

Luego, colóquelo encima del huésped trasplantado. A continuación, humedezca cuatro trozos de papel de filtro que contengan solución saturada de Holter, y en caso de que el huésped trasplantado se seque posteriormente, humedezca cuatro bolitas de Kimwipe cortado que contengan solución saturada de Holt Fretter. Colóquelas sobre los papeles de filtro.

A continuación, cierre la tapa. Coloque la placa de Petri sobre hielo. Luego transfiera el parénquima donador al agua de parénquima para su recuperación y regeneración.

Una vez completados todos los trasplantes, coloque el parian trasplantado en un incubador a 10 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, transfiéralo a una placa de Petri llena con agua de parian. Deje que el parian se desprenda por sí solo del papel de filtro o retírelo suavemente con pinzas, y cambie el agua de parian cada dos o tres días a partir de entonces.

La hibridación in situ con sonda de montaje muestra una distribución de células madre indistinguible de la del pariente tipo salvaje en el pariente fijado tres días después de la irradiación, que fue irradiado pero completamente protegido como control. Por otro lado, en el pariente que solo fue parcialmente protegido, dejando expuestas las regiones anterior y posterior, las células madre parecen haber sido abladas en las regiones no protegidas. Aquí se muestran las vistas dorsal y ventral de un pariente trasplantado con éxito.

Tres días después del trasplante, el injerto es claramente visible en las superficies dorsal y ventral, y está rodeado por un tejido despigmentado característico en la interfaz entre el injerto y el huésped. Sin embargo, el trasplante fallido no muestra tejido injertado visible en el sitio de trasplante. La hibridación in situ en preparaciones completas reveló la presencia de células madre solo en o alrededor de la ubicación del injerto, lo que indica el éxito del trasplante una vez dominado.

Los trasplantes pueden realizarse en tan solo cinco minutos cada uno. Con tasas de éxito cercanas al 90 a 100 % y una irradiación parcial, se puede aumentar considerablemente la escala. Suponiendo que el tamaño del campo de su irradiador sea suficientemente grande.