La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

Hola, soy Christine Beaton. Soy investigadora asistente en el laboratorio de George Chen, del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y en los próximos dos días les mostraré cómo preparar el TCGF, que significa factor de crecimiento de linfocitos T.

Por lo tanto, para nuestro cultivo celular de rutina, cuando no necesitamos un conocimiento preciso de la composición de las citocinas en el medio de cultivo, utilizamos el factor de crecimiento de células T, que es un sobrenadante S proveniente de un cultivo de bazo de ratas Lewis que contiene las citocinas necesarias para ayudar a la expansión de las células T. Así, la forma en que preparamos el FCT es: cuando sacrificamos ratas Lewis sanas, extraemos sus bázos, preparamos una suspensión de células individuales, eliminamos los glóbulos rojos mediante lisis y luego estimulamos las células mononucleares con concanavalina A, lo que inducirá a las células T a producir todas las citocinas necesarias para su crecimiento. Para generar el FCT, necesitamos activar las células.

Entonces, la forma en que lo hacemos es agregar lectina convalina, abreviada como conA, a nuestro cultivo celular. Cuando agregamos la conA a nuestro cultivo celular, se unirá al complejo del receptor de linfocitos T glicosilado, y al unirse a varios complejos simultáneamente, provocará lo que denominamos "capuchón" (capping). Es decir, se producirá una agregación, formando un cúmulo de todos los receptores en la superficie celular, lo cual inducirá una señal de activación en los linfocitos T.

Entonces, después de que las células se han activado, van a proliferar. Es decir, se van a agrandar y luego comenzarán a secretar citoquinas. Originalmente pensábamos que el TCGF era principalmente la interleucina dos, pero ahora sabemos que ese no es realmente el caso.

También contiene interferón gamma, TNF alfa y probablemente otras citocinas en cantidades muy pequeñas, que son apenas necesarias para mantener las células vivas tras 48 horas. En cultivo, las células han producido todas las citocinas que necesitamos. Por lo tanto, vamos a eliminar las células y, cuando hayamos eliminado las células y solo tengamos el sobrenadante, aún tendremos algo de conal libre en el sobrenadante. Y eso va a ser un problema porque realmente queremos utilizar nuestro factor de crecimiento de linfocitos T para mantener las líneas de células T en crecimiento.

Y si dejamos la conval libre en el medio, va a activar las células cuando no queremos que se activen. Para resolver ese problema, vamos a añadir un exceso de un azúcar que se unirá a toda la conval libre en el medio. De este modo, quedará completamente inactivada y no se unirá a otros receptores glicosilados en las células cuando añadamos el TCGF al cultivo.

Así que comencemos. El primer paso para este experimento consiste en extraer los bazo de una rata inmediatamente después de la eutanasia. Eso es exactamente lo que voy a hacer ahora utilizando instrumentos estériles.

Y una vez que tengo los bazo fuera, los colocaré en PBS suplementado con antibióticos, y como antibióticos uso penicilina y estreptomicina. Así que comencemos. Rocío al ratón con etanol al 70 % para asegurarme de no tener ninguna contaminación en mi cultivo.

Luego, utilizando mis instrumentos, voy a hacer un pequeño corte en la piel aquí. A continuación, retiro la capa muscular y el bazo aparece justo aquí. Entonces tomo otra pinza y extraigo suavemente el bazo sin dañarlo.

Retiro el tejido conectivo de esta manera. Así, ahora tengo un bazo. Por supuesto, tengo mucho cuidado de no dañar ninguna otra estructura dentro de la cavidad abdominal, ya que cualquier daño en el intestino provocará de inmediato la contaminación de mi bazo.

Luego voy a transferir mi bazo a un tubo que contiene PBS con antibióticos. Este tubo lo mantengo sobre hielo. Ahora he obtenido los bazos de tres ratas.

Así que estamos listos para comenzar y preparar una suspensión de células individuales a partir de esos bazo. Ahora que tengo mis bazos, los he llevado a una cabina de cultivo celular para preparar una suspensión de células individuales utilizando filtros celulares de 70 micrones. Así que necesitaré varias cosas para hacer la suspensión de células individuales a partir de los bazos.

Necesito instrumentos estériles, un par de pinzas y un par de tijeras. Luego coloco el émbolo de una jeringa estéril de un mililitro en la placa de Petri. Voy a colocar mis bazo en PBS con antibióticos.

Y en otra placa de Petri he colocado un filtro celular de 70 micrones en 10 mililitros de PBS más antibióticos. Así que el primer paso es asegurarse de que los bazo estén limpios, porque como se puede ver aquí, aún hay pequeños fragmentos de tejido conjuntivo, y voy a eliminarlos porque obstruirán rápidamente el filtro celular. Para ello, simplemente corto lo que no deseo y lo descarto en la tapa de la placa de Petri.

Ahora mis bazo están mayormente limpios, así que voy a tomar los bazo uno por uno, colocarlos en el colador celular y cortarlos en trozos pequeños. Luego mezclo los tres bazo. El siguiente paso es obtener una suspensión de células individuales. Por supuesto, como quiero mantener todo estéril, no toco en absoluto el colador celular y uso el émbolo de una jeringa estéril de un mililitro para presionar mis trozos de bazo a través del colador celular.

Y como puede verse en el exterior del molinillo de células, estoy obteniendo una suspensión de células individuales. Así que, aunque en esta primera pasada aún tengo algunos fragmentos pequeños de bazo, ya voy a extraer la suspensión de células individuales. Ya la he transferido a un tubo de 50 ml que tengo almacenado en hielo.

Y voy a rellenar nuevamente mi filtro celular con 10 mililitros más de PBS y antibióticos. Así que tomo otros 10 mililitros aproximadamente de mi PBS con antibióticos; no es necesario que sean exactamente 10 mililitros, ya que solo estamos lavando. Lo coloco en el filtro celular y luego sigo el mismo procedimiento.

Regreso a la jeringa y presiono un poco más a través del ocid. Por supuesto, nunca logrará pasar todo porque habrá tejido conjuntivo y pequeños fragmentos de grasa que no pude eliminar y que permanecerán en el filtro celular. Pero debería obtener la mayor parte del bazo en el filtro celular.

Luego repito exactamente lo que hice anteriormente. Voy a recolectar mi suspensión de células individuales y añadirla al mismo diente. Para este momento, casi no queda nada de la malla en el separador celular y el PBS que sale está mucho más claro. Voy a realizar un lavado más y en este punto deberíamos haber extraído la mayor parte de las células.

Ahora tengo mi suspensión individual de células PLE y voy a centrifugarlas simplemente para obtener un pellet. Centrifugar durante ocho a 10 minutos será suficiente. Ahora hemos centrifugado nuestras células PLE y tenemos un buen pellet.

Entonces, lo que voy a hacer es eliminar el sobrenadante y luego voy a lisar los glóbulos rojos. Así que voy a suspender los miocitos y los voy a colocar en cloruro de amonio. Es una solución de cloruro de amonio 0,15 M y voy a utilizar cinco mililitros por bazo.

Entonces, como tengo tres bazo, voy a usar 15 mililitros de cloruro de amonio y lo haré sobre hielo. Para lisar los eritrocitos, voy a pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo durante tres minutos. Bien, usaremos esta toma con la mayor exposición aquí.

Ahora he analizado los electrocitos durante tres minutos. Voy a llenar mi tubo con PBS, aunque también se puede usar medio. Esto sirve para devolver la osmolaridad de la solución al rango normal para las células.

Y voy a centrifugar las células como lo hice anteriormente durante ocho a 10 minutos para obtener el sedimento. Luego, las lavaré dos veces utilizando el mismo PBS con antibióticos. Ahora hemos centrifugado las células tras la aislación de los electrocitos, y no se preocupen, nunca se logra una liberación del cien por cien de los electrocitos.

Entonces, el botón seguirá siendo rojo, pero el sobrenadante estará más claro. Ahora voy a vaciar el sobrenadante, resuspender el botón, agregar algo de PBS hasta 50 ml, centrifugar y repetir este paso una vez más, de modo que tendré dos lavados. Luego podré contabilizarme. He lavado los miocitos dos veces y luego los he suspendido en medio de cultivo y los he contado utilizando el citómetro.

Como era de esperar. De tres bazo obtuve alrededor de 600 millones de células, lo cual es esperado ya que un bazo normalmente nos proporciona entre 200 y 250 millones de células. Entonces, lo que voy a hacer ahora es sembrar mis células a 2 millones por mililitro en mi medio que ha sido suplementado con 10% de suero de feto bovino.

Y a ese medio voy a añadir dos microgramos por mililitro de conc A para estimular las células. Y después simplemente voy a colocar las células en el incubador durante 48 horas. Las células han permanecido en el incubador durante 48 horas y, como les mostraré, han crecido bastante bien.

El medio ha adquirido un color naranja. Así que ahora estamos listos para finalizar nuestra preparación del TCGF. Como recordarán, agregué con carnaval a mi suspensión celular para activar las células.

Entonces, la concanavalina A es una lectina. Se unirá a los azúcares presentes en todos los receptores de la célula T y activará artificialmente todas esas células. El problema que tenemos ahora es que aún queda algo de concanavalina A en el sobrenadante celular.

Y dado que vamos a utilizar una snat en otros cultivos de linfocitos T para expandir las células, no queremos que la con carnaval esté presente en esos cultivos celulares. Por lo tanto, para eliminarla, voy a agregar un exceso de azúcar a la cual se une la con naval, y ese azúcar es la metil alfa D citosa, mostrada aquí. Voy a agregar un exceso de este azúcar y disolverlo completamente.

Va a unirse a toda la concentración restante de conc naval en una. Y una vez que esto esté hecho, voy a filtrar estérilmente los sobrenadantes celulares y voy a congelar alícuotas para su uso en las próximas semanas o meses. Así que comencemos con este último paso. Estoy añadiendo el sobrenadante de cultivo celular a tubos de 50 ml para poder centrifugarlos y eliminar las células.

Así que simplemente lleno tantos tubos como sean necesarios y no lo hago en la cabina de cultivo; podría hacerlo, pero como de todas formas necesito filtrar mi solución al final porque estoy agregando el azúcar, que no es estéril, simplemente lo hago sobre la mesa de trabajo. Es más fácil. Ahora he vertido todas mis células y sobrenadante en mis tubos Falcon de 50 ml.

Ahora los llevaré a la centrífuga y los centrifugaré durante aproximadamente 10 minutos. La única razón para centrifugarlos es hacer un pellet de las células, de modo que obtenga sobrenadantes claros. Las células ya han sido sedimentadas, por lo que el sobrenadante está claro y eso es exactamente lo que deseaba recolectar.

Así que voy a recoger todo el sobrenadante en un matraz limpio de 150 centímetros cuadrados. Y a este matraz voy a añadir el azúcar. Mientras las células se sedimentaban, pesé suficiente azúcar para añadir 15 miligramos por ml de sobrenadante.

Voy a dejar que se disuelva completamente y, después, voy a filtrar estérilmente mi sobrenadante. Ahora voy a añadir el azúcar: 15 miligramos por ml de sobrenadante. Vuelvo a colocar la tapa y, como no estoy trabajando en condiciones estériles, no importa si entra aire en la tapa; mezclo hasta que todo el azúcar se haya disuelto.

Eso debería ser bastante rápido. Sí, todo el azúcar ya se ha disuelto. Así que todo lo que tengo que hacer es filtrar estérilmente el sobrenadante y luego lo voy a alícuotar.

Normalmente, hago alícuotas de 10 a 15 ml que almaceno a menos 20 grados. Alícuotas como estas pueden almacenarse durante varios meses. También puede almacenar su TCGF en el refrigerador, pero en ese caso, lo usaría dentro de los próximos 10 a 15 días.

En los últimos dos días, les he mostrado cómo preparar el factor de crecimiento de linfocitos T, y este sobrenadante es muy sencillo de elaborar y muy económico de preparar. Por ello, lo utilizamos con frecuencia en el laboratorio para mantener nuestras líneas de linfocitos T en cultivo sin necesidad de comprar cócteles costosos de citocinas. Así que les deseamos éxito en sus experimentos.