Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Virus de ARN de cadena negativa Lyco. El genoma de los virus de la influenza se empaqueta en forma de complejos de ribonucleoproteína viral, o VR nps, en los cuales el genoma de cadena sencilla está encapsulado por la proteína nuclear y asociado con el complejo de polimerasa de cúrcuma formado por las subunidades PA, PB uno y PB dos, para purificar complejos intactos a partir de células de mamífero infectadas. Las células HeLa se incuban con virus de la influenza recombinante marcado con strept.

Una vez que el virus entra en las células, el ARN viral se sintetiza en los núcleos tras la infección; luego, las células se lisan mediante un detergente y se fraccionan en fracciones citoplasmática, nuclear y de cromatina mediante centrifugación y un protocolo de fraccionamiento de cromatina basado en lisis. Finalmente, los VRP con etiqueta strept se purifican por afinidad a partir de cada fracción. El análisis de la composición proteica y de ARN de los VRP purificados mediante tinción con plata demuestra que, utilizando este protocolo, incluso los VRP fuertemente unidos a la cromatina pueden aislarse de forma intacta. Por lo tanto, una de las principales ventajas de nuestro protocolo, en comparación con los métodos estándar para la purificación por afinidad de complejos ribonucleoproteicos del virus de la influenza, es que mediante nuestro método es posible purificar los VRP a partir de la cromatina de células infectadas, que se sabe es el sitio de síntesis del ARNm del virus de la influenza.

Por lo tanto, nuestro método podría utilizarse para responder preguntas sobre la regulación de la replicación y la transcripción virales, como, por ejemplo, qué factores virales o celulares, así como qué modificaciones postraduccionales son necesarias para, por ejemplo, la síntesis de ARNm viral o también la síntesis de ARN genómico viral. Así, los investigadores nuevos en este método podrían encontrar algunas dificultades, ya que la fraccionamiento subnuclear es muy sensible a las condiciones bioquímicas y también puede variar considerablemente entre diferentes líneas celulares. Comience este protocolo con células HeLa infectadas con el virus de la influenza RWSN PB2 Strep, que tiene una etiqueta Strep fusionada genéticamente al extremo C del subunidad PB2, a una multiplicidad de infección de tres.

Lave las células una vez con PBS frío, luego agregue 12 mililitros de PBS frío y retírelas del recipiente. Utilizando un raspador de goma, transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros y forme un pellet por centrifugación.

El aspecto más difícil de este procedimiento es el protocolo de fraccionamiento celular. Los núcleos celulares son muy sensibles a los procedimientos de homogenización y mezcla, y si se realiza de forma incorrecta, puede arruinar fácilmente un extracto de cromatina. Por lo tanto, es muy importante seguir no solo las técnicas de homogenización, sino también el manejo general de los lisados tal como lo mostramos aquí.

Tras la aspiración por centrifugación, suspenda el sedimento celular en 10 mililitros de tampón de sacarosa frío. Coloque una punta de pipeta de 200 microlitros en una pipeta de suero plástica de 10 mililitros y pase las células a través de ella para romper los agregados celulares. Incube la suspensión en hielo durante 10 minutos.

Invierta periódicamente las células suavemente para resuspenderlas. A continuación, agregue Non IET P 40 hasta una concentración final de 0,5 % y vortexee a alta velocidad durante 15 segundos; centrifugue inmediatamente durante 10 minutos a 3.500 ×g a cuatro grados Celsius en una centrífuga de mesa. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros.

Guarde el sobrenadante a cuatro grados Celsius. Esta es una fracción citoplasmática. El precipitado debe ser más pequeño y más blanco que el precipitado celular original, como se muestra aquí.

Si el protocolo se completará en un momento posterior, almacene el pellet celular a cuatro grados Celsius. De lo contrario, continúe lavando el pellet en cinco mililitros de tampón frío de sacarosa y centrifugando como antes. Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante y re suspenda el pellet, que contiene los núcleos, en 1,5 mililitros de tampón frío de extracción del plasma nuclear.

Transfiera el precipitado resuspendido a un homogenizador de vidrio de cuatro mililitros enfriado, con un pistilo ajustado, y homogenice los núcleos con 20 movimientos. Evitando la formación de espuma, la resistencia debe aumentar después de aproximadamente 10 movimientos. Para confirmar una homogenización eficiente, examine la muestra bajo un microscopio de contraste de fases.

Los núcleos ya no deben ser redondos, sino que deben tener formas irregulares y parecer como si hubieran estallado. Una vez que los núcleos hayan sido homogeneizados, transfiéralos a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Incube el homogenato en una rueda rotatoria a cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Luego, centrifugue a 16.000 ×g en una microcentrífuga durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante, que es la fracción nucleoplasmática, a un tubo de 1,5 mililitros y almacénelo a cuatro grados Celsius. A continuación, resuspenda el precipitado en 1,5 mililitros de tampón de digestión precalentado a 37 grados Celsius.

A continuación, incubar la fracción durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Luego, agregar 42 microlitros de cloruro de sodio cinco molar para llevar la concentración final de cloruro de sodio a 150 milimolar y después incubar durante 20 minutos en hielo. Centrifugar a 16.000 × g en una microcentrífuga a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

Después de centrifugar, retire el sobrenadante y almacénelo a cuatro grados Celsius. Esta es la fracción CH uno 50. Resuspenda el precipitado en 1,5 mililitros de tampón frío de alta salinidad e incube durante 20 minutos en hielo.

Centrifugar a 16.000 × g en una microcentrífuga a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y almacénelo a cuatro grados Celsius. Esta es la fracción CH 500.

Saque las fracciones guardadas durante el protocolo de fraccionamiento y colóquelas en hielo. Luego, agregue 300 microlitros de cloruro de sodio cinco molar a la fracción citoplasmática. A continuación, transfiera 100 microlitros de perlas de strep T en Sphero empaquetadas por fracción a un tubo cónico de 15 mililitros.

Añada 10 volúmenes de tampón de lavado de estreptavidina a las perlas. Invierta el tubo para mezclar y centrifugue durante cinco minutos a 1000 veces G en una centrífuga de mesa, deseche el sobrenadante.

Repita el lavado con tampón dos veces, luego resuspenda el precipitado en un volumen igual de tampón de lavado de strep y agregue 200 microlitros de streptavidina en suspensión de perlas lavada a cada fracción. Incube las tubos en rotación durante una hora a cuatro grados Celsius. A continuación, centrifugue los tubos durante un minuto a 1000 × g y a cuatro grados Celsius, y deseche el sobrenadante.

Luego, agregue un mililitro de tampón de lavado a las perlas que se incubaron con la fracción citoplasmática en un tubo de 15 mililitros. Añada el tampón de lavado y transfiera las perlas a un tubo de 1,5 mililitros. Lave las perlas durante un minuto, luego centrifugue los tubos durante un minuto a 1000 ×g a cuatro grados Celsius.

Repita dos veces después del último paso de lavado. Elimine todos los rastros del tampón de lavado utilizando una punta de pipeta plana. Luego, agregue 100 microlitros de tampón de elución y mezcle suavemente; coloque los tubos en hielo durante 15 minutos.

Durante la incubación, mezcle ocasionalmente las perlas golpeando suavemente el fondo de los tubos. Después de 15 minutos, centrifugue durante un minuto a 1000 × g a cuatro grados Celsius. Recopile la fracción Senna que contiene los VRP eluidos con etiqueta Strep.

Él, nuestras células fueron infectadas con la cepa del virus de la influenza WSN durante nueve horas, y los lisados fraccionados se analizaron mediante inmunotransferencia, como se muestra aquí. El aislamiento suave de núcleos extrae eficientemente proteínas citoplasmáticas, como la tubulina, al tiempo que evita la liberación de proteínas nucleares abundantes. Observe que la fracción de cromatina extraída con baja salinidad está enriquecida en proteínas importantes para la transcripción.

Mientras que la fracción de alta sal contiene principalmente nucleosomas para determinar la composición proteica de la fracción citoplasmática eluida, los VNPs de células HE infectadas durante nueve horas con virus sin etiqueta, RWSN o RWSN PB2 strep, se analizaron mediante tinción con plata, como se muestra para un eluato citoplasmático. Aquí existe una alta proporción de NP respecto a PA, PB1 y PB2, evidenciada por la banda principal por encima de 55 kilodaltonos en comparación con las bandas entre 95 y 100 kilodaltonos, lo que sugiere que la mayor parte del PB2 strep se purifica como parte de un VNPR completamente formado, es decir, se captura poca polimerasa soluble. Los VNPs purificados tras nueve horas de infección con RWSN PB2 strep o RWSN se tiñeron con plata, como se muestra en este gel de tinción con plata. Los VNPs pueden purificarse a partir de las cuatro fracciones celulares tras nueve horas de infección.

La mayor concentración de vRNP se encuentra en el plasmo nuclear, aunque también se pueden purificar porciones considerables del citoplasma y de la cromatina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar altos rendimientos de complejos de ribonucleoproteínas intactos del virus de la influenza a partir del núcleo de células infectadas. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar utilizar tampones limpios y evitar exponer innecesariamente las muestras a la temperatura ambiente, ya que de este modo se puede evitar tanto la degradación del ARN y de las proteínas como la desensambladura de los complejos proteicos.

Y no olvide que trabajar con un virus de la influenza infeccioso puede ser peligroso. Todos los pasos deben realizarse bajo una cabina de seguridad biológica de nivel dos hasta que se haya agregado NP 40 a los lisados.