Colección Protocolo de páncreas humano

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar el páncreas humano de manera que se mantenga la orientación anatómica. Esto se logra eliminando el duodeno y el bazo del páncreas, y luego retirando la grasa y los vasos excesivos del páncreas. El segundo paso consiste en pintar la superficie anterior con tinta azul y la superficie posterior con tinta negra.

A continuación, el páncreas se divide en tres regiones. Cada región se corta transversalmente en lonjas uniformes y se coloca en casetes de parafina, moldes de OCT o se tritura más finamente y se coloca en viales. Finalmente, se recogen muestras de las tres regiones del páncreas, manteniendo la orientación anatómica correcta para análisis posteriores.

Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en la investigación de la diabetes tipo uno, como los mecanismos subyacentes a la pérdida de masa o función de las células beta, y la naturaleza del ataque de las células inmunitarias. La demostración visual del método de procesamiento del páncreas es fundamental, ya que mantener la orientación in vivo del páncreas requiere atención al detalle. La procedimiento será demostrado por Linda Snyder, histotecnóloga, y Emily Montgomery, científica biológica, en mi laboratorio.

Comience preparando todos los materiales necesarios para el procedimiento. Primero, etiquete los casetes que contendrán los bloques de parafina con un identificador del donante, el tipo de muestra, el número de alícuota y cualquier información adicional. A continuación, etiquete los moldes de OCT de la misma manera.

Corte suficientes trozos de papel de aluminio para envolver cada bloque de OCT y colóquelos aparte para usarlos más tarde. Prepare todos los frascos necesarios para almacenar las muestras frescas y congeladas. Añada posteriormente RNA y medio RPMI cuando corresponda.

A continuación, prepare las áreas de trabajo, coloque las tablas de disección, los instrumentos esterilizados y todos los demás materiales necesarios para el procedimiento tanto dentro de una cabina de seguridad biológica como sobre una encimera. Tenga todos los casetes y moldes de OCT organizados en orden de uso cercanos. Prepare un baño de congelación añadiendo suficiente isopentano para cubrir el hielo seco en el fondo de una caja de poliestireno.

Para comenzar la disección, retire el duodeno y el bazo. Comience a separar el duodeno y el páncreas por un extremo y continúe hasta que estén completamente separados. El bazo está unido débilmente y se puede retirar fácilmente de la grasa y del páncreas.

A continuación, limpie el páncreas de vasos grasos y nervios accesorios utilizando una combinación de disección roma y afilada. Separe la grasa y los ganglios linfáticos para procesarlos posteriormente. Una vez limpio, coloque el páncreas sobre una tabla de disección cubierta con toallas de papel.

Mantener la orientación correcta del páncreas es el aspecto más difícil de este procedimiento. Para asegurar el éxito, las superficies anterior y posterior se pintan con tintas de colores diferentes. Sumerja un aplicador de algodón en tinta azul, extienda la tinta sobre la superficie anterior del páncreas y absorba el exceso.

A continuación, sumerja un nuevo aplicador en tinta negra y extiéndala sobre la superficie posterior del páncreas. Devuelva el páncreas a su orientación normal. Con la superficie anterior orientada hacia arriba, el páncreas ya está listo para ser cortado en tres secciones.

Primero, corte la unión entre la cabeza y el cuerpo. A continuación, divida la porción restante en partes aproximadamente iguales para separar el cuerpo y la cola, y registre el peso de cada región del páncreas. Comience con la sección de la cabeza.

Divida cada región en secciones de aproximadamente 0,5 centímetros cortando de forma transversal, de manera similar a cómo se corta una barra de pan. Una vez que cada región del páncreas haya sido seccionada, retire la última sección de la región de la cabeza, que es la sección de la unión entre cabeza y cuerpo, y colóquela en una tabla de disección separada. Pique esta sección en trozos pequeños y divida los trozos equitativamente entre viales criogénicos etiquetados con y sin ARN.

Posteriormente, los viales se congelan. Siguiendo procedimientos estándar. Repita este procedimiento para la sección de la unión del cuerpo y la cola.

Una vez que se hayan recolectado las muestras picadas, incline todas las secciones transversales hacia la derecha. Se eliminarán secciones alternas de cada región. Para los bloques de parafina y OCT, retire la primera sección para el bloqueo en parafina.

Si una sección es demasiado grande, córtela por la mitad. Etiquete los casetes como A y B. Si la pieza aún es demasiado grande, corte cada sección perpendicularmente al corte anterior y luego etiquete los casetes de la A a la D en sentido horario. Como se muestra aquí, coloque el casete de modo que la etiqueta quede a la izquierda.

A continuación, coloque el tejido en la cubeta y cierre la tapa. Transfiera la cubeta a un recipiente que contenga formol tamponado neutro. Numere el bloque secuencialmente dentro de cada región, comenzando con la sección más medial para los bloques de OCT.

Vierta una capa fina de medio OCT en un molde previamente etiquetado. Antes de introducir el tejido, cúbralo con medio OCT y congele rápidamente la muestra para su uso posterior, regresando al tejido que se había apartado anteriormente. Aísle los ganglios linfáticos pancreáticos recortando la grasa y el tejido conectivo que rodean la cápsula del ganglio. Coloque los ganglios en un recipiente estéril que contenga DMEF y triture los ganglios grandes en trozos de no más de 0.5 centímetros.

Una vez aislados los ganglios linfáticos pancreáticos, divida el tejido entre los viales y casetes preparados para su procesamiento posterior. Tras finalizar con los ganglios linfáticos, se tritura el bazo y se almacena de manera similar. Para procesar el duodeno, utilice una gasa humedecida para limpiar la mucosa de moco, corte la mucosa y luego divídala en secciones.

Divida las muestras de mucosa como se mostró anteriormente. Mediante este procedimiento, se recogen muestras representativas de cada región del páncreas, como se observa aquí. Los pesos de las regiones de la cabeza, el cuerpo y la cola fueron aproximadamente iguales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar un páncreas humano en diferentes tipos de muestras, específicamente la capacidad de mantener la orientación, así como de cómo aislar nódulos linfáticos de la grasa peripancreática.