Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar rápidamente células dendríticas intestinales o CD y macrófagos de ratón para su caracterización fenotípica y funcional. Esto se logra primero obteniendo el tejido intestinal. El segundo paso consiste en disociar el epitelio intestinal de la lámina propia.

A continuación, la lámina propia intestinal se digiere durante las etapas finales del procedimiento. Las células de la lámina propia se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorescencia y se seleccionan para poblaciones celulares específicas. En última instancia, las poblaciones de DC intestinales y macrófagos pueden caracterizarse y purificarse con mayor precisión para estudios funcionales destinados a evaluar la producción de citoquinas, la presentación de antígenos y la regulación de las células inmunitarias.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que la rapidez de la digestión del tejido asegura una expresión óptima de los antígenos de superficie celular, la viabilidad celular y o la integridad celular. Tras la eutanasia del ratón y la confirmación de la muerte mediante el reflejo de pellizco en el dedo del pie, rocíe una prueba con etanol al 70 % sobre el abdomen y el tórax del animal. A continuación, utilice un par de tijeras para realizar una pequeña incisión horizontal en la parte media del abdomen y retire la piel hacia atrás para exponer el peritoneo.

Abra el peritoneo usando tijeras después de cortar en el esfínter pilórico para separar el estómago del intestino delgado superior y utilice pinzas para separar cuidadosamente el mesenterio. Corte nuevamente en la válvula ileocecal para liberar todo el intestino delgado del intestino grueso. Continúe separando el mesenterio del intestino grueso y realice un corte en el borde anal.

Utilice tijeras para abrir longitudinalmente el colon y use C-M-F-P-B-S a temperatura ambiente para lavar los contenidos fecales y el moco fuera de la luz intestinal. Luego, utilice las tijeras y la pinza para, macroscópicamente, disecar las placas de Peyer a lo largo de la superficie antimesentérica del intestino delgado, y abrir longitudinalmente el intestino delgado.

A continuación, limpie el lumen del intestino delgado de contenidos fecales y moco con más C-M-F-P-B-S a temperatura ambiente. Por separado, corte el intestino delgado y el intestino grueso en trozos de aproximadamente 1,5 centímetros y coloque los trozos en tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de C-M-F-H-B-S-S precalentado con FBS y 2 milimolar de EDTA. Coloque cada tubo cónico de 50 mililitros horizontalmente en un agitador orbital, agitando los tubos a 250 RPM durante 20 minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, coloque un colador de malla metálica individual sobre un recipiente para desechos. Vierta el contenido de cada tubo cónico de 50 mililitros a través de la malla para recuperar los fragmentos de intestino y luego colóquelos en nuevos tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de C-M-F-H-B-S-S precalentado con FBS y 2 milimolar de EDTA. Finalmente, coloque los tubos nuevamente en el agitador orbital durante 20 minutos más.

Después de la segunda ronda de agitación, vierta el contenido de cada tubo a través del colador. Nuevamente, absorba el medio en exceso con una toalla de papel y luego transfiera los fragmentos de intestino a un pequeño recipiente plástico para suero. El aspecto más difícil de esta técnica es la digestión del tejido para garantizar el éxito; deben considerarse todos los parámetros diferentes, como la duración de la digestión, las propiedades de la colagenasa, la integridad del tejido y el tamaño del tejido que se va a digerir, todo ello utilizando tijeras con rapidez.

Corte las piezas intestinales y luego agregue el intestino picado a un tubo cónico de 50 milímetros que contenga 20 mililitros de solución de colagenasa. Coloque el tubo cónico horizontalmente en el agitador orbital y digiera los fragmentos intestinales a 200 RPM durante 10 a 20 minutos a 37 grados Celsius. Vortexe brevemente el tubo para asegurar la disociación completa de cualquier tejido intestinal restante y luego filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 micrones directamente hacia un tubo cónico de 50 mililitros.

Finalmente, complete el tubo cónico con C-M-F-H-B-S-S con FBS y centrifugue la solución celular dos veces durante cinco minutos a 425 veces G a cuatro grados Celsius. Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular en C-M-F-H-B-S-S frío con FBS, y coloque las muestras en hielo. Después de teñir las células para las proteínas de superficie de interés.

Comience creando un diagrama de puntos excluyendo las células que son positivas para la tinción de células muertas, como se muestra aquí. A continuación, excluya los eventos dobletes como se indica aquí y aquí. Ahora utilice los canales de dispersión directa y lateral para seleccionar las células de interés, asegurándose de excluir los restos celulares.

Luego, cree otro diagrama de dispersión con puerta sobre el antígeno positivo para CD45 y positivo para IAB. En un diagrama de dispersión separado para las células presentadoras de antígenos, cree regiones para distinguir subpoblaciones específicas de DC y macrófagos. La región R1 mostrada aquí incluye las células positivas para CD11c y débilmente positivas o negativas para CD11b.

La región R dos delimita las células que tienen un nivel similar de expresión en la superficie de CD11C al de las células en la región R uno, pero que además expresan CD11B. Las regiones R tres designan las células que son positivas para CD11B y negativas tenues para CD11C. Estas tres regiones pueden analizarse posteriormente para la expresión de F4/80 y CD103 con el fin de diferenciar las poblaciones de macrófagos y de DC, respectivamente. Como se observa en este diagrama de dispersión, las células positivas para CD11C y negativas tenues para CD11B en la región R uno expresarán altos niveles del CD103 alfa y bajos niveles de F4/80.

Este diagrama de puntos muestra que las células positivas para CD11B y positivas para CD11C en la región R2 estarán compuestas tanto por DCs como por macrófagos, según su expresión dicotómica de CD103 y F480. Finalmente, basándose en su perfil fenotípico positivo para F480 y negativo para CD103, la región R3, las células positivas para CD11B y negativas para CD11C delimitadas (gated) consistirán en macrófagos. La relación entre la duración de la digestión del tejido y el rendimiento total de células, así como la expresión de CD11B y CD11C, se ilustra en las siguientes seis figuras. El tejido intestinal digerido durante tres minutos produce un número bajo de células totales, lo que resulta en pocas DCs y macrófagos disponibles para su caracterización; en cambio, la digestión del tejido durante 11 minutos produce un rendimiento robusto de células viables, obteniendo poblaciones de DCs y macrófagos que expresan altos niveles de CD11B y CD11C y que son fenotípicamente distintas.

En contraste, la digestión durante 50 minutos produce un rendimiento celular similar al de la digestión optimizada. Sin embargo, la delimitación de las diferentes poblaciones celulares mediante CD11b y CD11c se vuelve más difícil, ya que la expresión de CD11c disminuye y el número de células muertas aumenta.

Por lo tanto, al optimizar los parámetros para la digestión del tejido intestinal, se puede obtener rápidamente un rendimiento celular robusto. Como resultado, el aislamiento rápido de DCs y macrófagos intestinales de ratón puede ser útil para evaluar las propiedades funcionales de las células inmunitarias con antígenos de superficie intactos.