Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

En este video, describimos un procedimiento eficiente en tiempo y costo para la expresión de proteínas secretadas a partir de células HEK 293T. Inicialmente, se prepara un cultivo de células HEK 293T al 40 % de confluencia en una placa de seis pocillos. Luego, se prepara una mezcla de transfección diluyendo GeneJuice y los plásmidos de prueba en medio libre de suero.

La mezcla de transfección se deposita sobre las células, las cuales luego se incuban a 37 grados Celsius para permitir la expresión de proteínas. La detección de la proteína en el sobrenadante puede realizarse mediante inmunotransferencia (western blot). Una vez identificado un constructo adecuado, el procedimiento puede ampliarse utilizando fábricas de células de 10 capas.

Las células se transfectan utilizando PEI como reactivo de transfección. Las proteínas pueden obtenerse a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante filtración tangencial seguida de cromatografía de afinidad. En última instancia, esta plataforma permite la expresión de una amplia gama de macromoléculas en cantidades del orden de miligramos.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la expresión en células de insecto basada en el virus baculovirus, es que se pueden analizar y escalar un gran número de constructos para su expresión, obteniendo resultados en tan solo tres semanas. Este procedimiento será demostrado por Hello Aiden para Shada Zini y Jonathan Cook. Tres estudiantes de posgrado de mi laboratorio comienzan sembrando 250.000 células HEC 293T por pocillo en un volumen de un mililitro en una placa de seis pocillos, añadiendo un mililitro por pocillo de DMEM suplementado con 10 %FBS, y agitando suavemente la placa para distribuir las células de manera uniforme.

A continuación, incubar las células durante la noche en un incubador humidificado con 5%de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Una vez que las células alcancen una confluencia de aproximadamente 40%, reemplace el medio con dos mililitros de medio fresco para preparar la mezcla de transfección. En primer lugar, retire 90 microlitros de DMEM sin suero en un tubo eppendorf.

Luego, agregue tres microlitros de gene juice, el reactivo de transfección, mezcle suavemente el contenido del tubo e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 10 microlitros de un stock de 100 nanogramos por microlitro del plásmido purificado en mini prep, ADN, para ser transfectado.

Mezcle el contenido del tubo y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para realizar la transfección, agregue la mezcla sobre las células HEC 2 9 3 T. Gota a gota, agite suavemente la placa para distribuir uniformemente la mezcla de transfección.

A continuación, incubar las células a 37 grados Celsius. Veinticuatro horas después, añadir un mililitro de medio fresco a cada pocillo e incubar durante 48 horas adicionales. Tres días después de la transfección, recolectar el sobrenadante y detectar los niveles de expresión de la proteína de interés mediante inmunotransferencia tipo western.

Una vez que se ha identificado un constructo adecuado, el procedimiento de transfección puede ampliarse. Utilizando fábricas de células de 10 capas, llene una fábrica de células con 1,2 litros de DMEM suplementado con 5 %FBS. A continuación, agregue 200 millones de células HEC 2 9 3 T, distribuyendo las células uniformemente en todas las capas.

Cuatro matraces cuadrados para cultivo celular de 225 centímetros cuadrados crecidos hasta una confluencia del 100 % contienen aproximadamente 200 millones de células. Incubar las células a 37 grados Celsius durante la noche. Preparar la mezcla de transfección en un matraz T75 diluyendo 840 microgramos de ADN en 84 mililitros de PBS estéril al 1×.

Añada 2,5 mililitros de una solución de ion polietileno o PEI de un miligramo por mililitro e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución debe volverse turbia. A continuación, vierta lentamente la mezcla de transfección en la fábrica de células y distribúyala completamente.

Capas generales. Añada ácido valproico a una concentración final de cuatro milimolares. Esto aumentará los rendimientos de expresión una vez que se haya agregado la mezcla de transfección.

Incube el cultivo a 37 grados Celsius durante cuatro días para permitir la expresión de proteínas. Recoleccione el medio cuatro días después de la transfección y limpie inmediatamente el biorreactor para su reutilización; centrifugue el medio recolectado a 6.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y filtre a través de un dispositivo de filtración al vacío con embudo estéril de 0,22 micrómetros para eliminar cualquier materia particulada. Luego, utilice el sistema de filtración tangencial Centra-Mate para concentrar el sobrenadante hasta 75 mililitros.

Una vez que el sobrenadante se concentra, la proteína de interés puede purificarse mediante cromatografía de afinidad. En este experimento, purificamos las subunidades marcadas con HA del dominio extracelular de los receptores humanos AAL2 utilizando el sistema a gran escala descrito aquí, seguido de cromatografía de alta afinidad con anti-HA. Como se muestra en este análisis de SDS-PAGE teñido con Coomassie.

Los dominios extracelulares de las subunidades alfa y gamma del receptor de interleucina dos migran a los pesos moleculares de 40 kilodalton y 46 kilodalton. La heterogeneidad de los glicanos EnLink presentes en IL dos R alfa y IL dos R gamma provocó un ensanchamiento de la banda en el gel de electroforesis SDS-PAGE. La banda de mayor peso molecular representa albúmina sérica bovina contaminante.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar proteínas a partir de cultivos celulares humanos utilizando fábricas celulares de 10 capas. No olvide que las células HC 2 93 T se consideran peligrosas para la salud y deben manipularse en un nivel de bioseguridad dos. Siempre use ropa protectora personal adecuada y las superficies deben desinfectarse según las normas institucionales y gubernamentales.