Guiada por tomografía computarizada dominio del tiempo de fluorescencia difusa tomografía en pequeños animales para la localización de biomarcadores de cáncer

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de fluorescencia de la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico en un modelo ortotópico de glioma en ratón. Esto se logra inoculando el hemisferio cerebral izquierdo de un ratón A IIC con células de glioma humano U251 que expresan la proteína verde fluorescente. Después de que el tumor ha crecido durante dos semanas, se inyecta al ratón un cóctel de dos trazadores fluorescentes.

A continuación, se realiza una imagen del ratón en un sistema de rayos X para pequeños animales con el fin de obtener datos anatómicos necesarios para una reconstrucción precisa de la imagen. Estos datos se utilizan para posicionar anatómicamente la fuente y determinar las ubicaciones de detección del sistema de tomografía óptica, y se emplea un software personalizado para adquirir los datos de fluorescencia y construir la imagen final. En última instancia, este método puede generar una imagen de un tumor en función de su sobreexpresión del factor de crecimiento epidérmico mediante imágenes combinadas de fluorescencia y rayos X, cuya precisión puede compararse con la resonancia magnética con contraste.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la tomografía de fluorescencia en pequeños animales basada en dispositivos de acoplamiento de carga, es que la detección por conteo de fotones individuales mediante tubos fotomultiplicadores ofrece una sensibilidad y un rango dinámico mucho mayores para la detección de luz. Este método puede utilizarse finalmente para monitorear y evaluar el éxito de terapias moleculares mediante la medición de la expresión de sus dianas. Aunque los tumores subcutáneos se pueden imaginar fácilmente con métodos no tomográficos mediante imágenes de superficie, este sistema está diseñado para obtener imágenes a través de tejidos de hasta varios centímetros de grosor, lo que lo hace especialmente adecuado para visualizar la entrega de agentes de contraste y su fuga hacia tumores cerebrales.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la expresión de biomarcadores en cáncer, también puede aplicarse a otros estudios de enfermedades como infecciones, obesidad o aspectos relacionados con el envejecimiento, tales como el Alzheimer. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la naturaleza difusa de la propagación de la luz en el tejido biológico y a la dificultad de utilizar la tomografía de rayos X para la reconstrucción de luz difusa. La demostración visual de este método es fundamental.

Dado que los pasos de recolección de datos y reconstrucción de imágenes pueden ser difíciles de aprender, es importante asegurarse de que los datos obtenidos del sistema fluorescente estén bien calibrados. El paquete de software near fast fue diseñado para leer datos ópticos y utilizar imágenes de tomografía de rayos X para crear una malla de elementos finitos, que se emplea como una plantilla espacial para la reconstrucción de fluorescencia. Para comenzar, coloque un ratón desnudo atímico anestesiado sobre un campo quirúrgico estéril y confirme la profundidad de la anestesia antes de proceder; limpie y desinfecte la piel sobre el área de incisión.

Utilizando Betadine, coloque una gasa quirúrgica estéril sobre el sitio de incisión; con un escalpelo, realice una pequeña incisión ligeramente a la izquierda de la línea media y 0,5 centímetros por detrás de la línea intraocular. Limpie la superficie del cráneo eliminando cualquier tejido conectivo para poder identificar los puntos de referencia anatómicos. Una vez expuesto el cráneo, utilice un taladro de alta velocidad con una broca estéril de un milímetro para hacer un orificio ubicado dos milímetros a la izquierda de la línea central y dos milímetros por detrás del bgma.

Cargue una jeringa Hamilton Micros con una aguja roma de calibre 27 con las células que se implantarán. A continuación, coloque el ratón en un marco estereotáxico. Luego, confirme un plano quirúrgico y anestésico profundo mediante una compresión del dedo del pie y reemplace la cobertura quirúrgica sobre el animal.

A continuación, sujete la jeringa cargada al marco estereotáxico. Coloque la jeringa sobre el orificio en el cráneo e inserte la punta de la aguja tres milímetros por debajo de la superficie del cráneo. A continuación, retire la aguja un milímetro para crear un bolsillo.

El siguiente paso consiste en inyectar lentamente las células en el hemisferio cerebral izquierdo durante un período de cinco minutos. Una vez finalizada la inyección, retire la aguja y limpie el orificio con Betadine. Para evitar que las células crezcan fuera del sitio de inyección, retire al ratón del marco estereotáxico y rellene el orificio expuesto con cera ósea precalentada.

Por último, cierre el sitio de la incisión con sutura de nylon estéril 5-0. Devuelva el ratón a una jaula calentada y monitórelo hasta que se recupere; tras la recuperación, inyecte al ratón 130 microlitros de buprenorfina 0,1 miligramo por kilogramo por vía IP y permita que el tumor crezca durante 14 días antes de la obtención de imágenes. En el día de la obtención de imágenes del ratón, inicie el sistema para permitir que los láseres y los detectores de luz se calienten durante aproximadamente 20 minutos.

Para evitar derivas y la sensibilidad del sistema, coloque un difusor de líneas diseñado de 100 grados por cuatro grados exactamente en el centro del bastidor de imagen para dispersar los láseres de excitación entre los canales de detección del sistema con intensidad igual. Ajuste el ángulo del difusor manualmente para maximizar la cantidad de señal detectada por los cinco canales de recolección de luz. A continuación, coloque la densidad óptica.

Dos filtros de densidad neutra delante de todos los tubos fotomultiplicadores, denominados PMT, para la detección de fluorescencia y densidad óptica. Un filtro de densidad neutra delante de toda la detección de transmitancia. Los PMT recogen 100 funciones temporales de dispersión de pulsos o T psfs del láser, cada una con un tiempo de integración de un segundo para cada láser secuencialmente, normalizan cada TPSF mediante la referencia del láser, corrigen la deriva temporal en la referencia del láser y promedian sobre todas las iteraciones para cada detector y cada láser por separado.

Estas TPS promedio son las funciones de respuesta del instrumento específicas del detector utilizadas en la reconstrucción de imágenes ópticas 12 horas antes del procedimiento de imagen. Inyecte al ratón de prueba una mezcla de trazadores fluorescentes. La calibración precisa del sistema de tomografía fluorescente y la restricción del movimiento del animal son los aspectos más difíciles de este procedimiento.

La reconstrucción de la imagen es tan mal condicionada que incluso errores mínimos en la recopilación de datos pueden provocar errores significativos en la imagen reconstruida. Para garantizar que se recopilen datos precisos, inmovilizamos al ratón lo más posible y repetimos la calibración antes y después del escaneo para mejorar la probabilidad de obtener una calibración precisa. Cuando esté listo, coloque el animal anestesiado sobre los soportes de fibra de vidrio de la camilla de imagenología.

Después de colocar la cabeza en el cono nasal para la anestesia gaseosa continua, asegure los dientes en la barra de mordida y sujete al animal con cinta. El ratón debe colocarse aproximadamente en el centro del soporte de imagen. Esta posición puede guiarse girando el láser de excitación 180 grados alrededor del ratón, asegurándose de que el punto focal del láser ilumine un punto aproximadamente en el centro del ratón desde la perspectiva del láser en todos los ángulos.

Una vez posicionado correctamente, transfiera cuidadosamente la camilla de imagen y el ratón al escáner de micro-TC y obtenga información anatómica con una resolución isotrópica de 93 micrómetros para toda la cabeza del ratón. Visualice el conjunto de imágenes de TC y seleccione las secciones que se van a adquirir con el sistema de tomografía de fluorescencia. Transfiera cuidadosamente la camilla de imagen y el ratón de regreso al sistema de tomografía de fluorescencia.

Seleccione el número de posiciones de la fuente para cada corte de imagen, el tiempo de integración para cada medición de TPSF, el número de iteraciones para cada posición de la fuente y la posición y cantidad de cortes de imagen deseados a partir de la pila de imágenes de TC creada previamente. A continuación, coloque filtros delante de los PMT de detección de fluorescencia para bloquear toda la luz de excitación y filtros de densidad neutra delante de los PMT de detección de transmitancia. Para evitar la saturación de esos detectores, ejecute el software de adquisición de datos recopilando TPSF de fluorescencia y transmitancia en cada posición definida de fuente y detector, a ambas longitudes de onda de excitación.

Para cada conjunto de T psfs recopilados, supervise y registre la intensidad del láser mediante un canal de PMT de referencia. Determine la superficie externa del ratón y la ubicación del lecho de imagen. Utilice las varillas de soporte de las imágenes de TC y cree máscaras que cubran los límites del ratón y de la varilla de imagen.

Por separado, utilice la máscara del ratón para generar una malla de elementos finitos del animal mediante el software near fast. Localice las posiciones de la fuente y del detector del sistema de tomografía de fluorescencia sobre la superficie de la malla según las coordenadas de registro espacial de micro CT y fluorescencia. Elimine los puntos de datos ópticos asociados con las posiciones de la fuente o del detector que interactúan con la ubicación de la cama de imagen.

Las varillas de soporte normalizan los datos recopilados en cada posición de fuente-detector mediante la referencia del láser, corrigen la deriva temporal en la referencia del láser y ajustan las sensibilidades del filtro, las cuales fueron determinadas mediante pruebas experimentales al momento de la compra. Tome la razón de Born de los datos para cada posición de fuente-detector y multiplique por una simulación del modelo directo de transmitancia basada en la malla de elementos finitos del animal para propiedades ópticas uniformes. Esto se realiza para mitigar errores asociados con el acoplamiento del tejido de la fuente o del detector, calibrar los datos al modelo y ajustar los datos por otros aspectos de la discrepancia entre el modelo y los datos; construya un vector de datos compuesto por la diferencia escalada de los datos de la razón de Born recopilados a ambas longitudes de onda.

El factor de escala se elige para maximizar el contraste de unión a EGFR, realizar la reconstrucción de la imagen en el dominio temporal con los datos de diferencia calibrados utilizando la TPSF para cada canal de detección como entrada y crear mapas de fluorescencia del trazador dirigido con contraste mejorado observado. A continuación se muestra un ejemplo de una reconstrucción de fluorescencia superpuesta con una imagen anatómica de tomografía computarizada coregistrada de un ratón con un tumor de glioma ortotópico U251. El centro de masa del glioma determinado mediante la reconstrucción de fluorescencia se encontraba a menos de un milímetro del centro de masa del tumor, determinado mediante imágenes de resonancia magnética con contraste.

El software para la adquisición de datos está personalizado para este dispositivo, pero la mayoría de las técnicas de procesamiento de imágenes se pueden realizar utilizando el software near fasts disponible en @nearfasts.org. Por lo tanto, al llevar a cabo este procedimiento, es importante asegurarse de que tanto el sistema como los datos estén calibrados con precisión antes de la reconstrucción de la imagen. Esta calibración requiere que se tengan en cuenta la sensibilidad y las diferencias temporales entre los detectores tras la reconstrucción de la imagen de un trazador dirigido a un biomarcador.

La imagenología similar de un trazador no dirigido proporciona un medio para corregir la captación no mediada por receptores. Esto permite cuantificar la cantidad de unión del trazador, así como la densidad de receptores in vivo tras su desarrollo. Esta técnica inspiró a otros investigadores a diseñar sistemas de tomografía de fluorescencia guiados por imagenología de rayos X, y allanó el camino para la imagenología de todo el cuerpo en animales más grandes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de tomografía de fluorescencia difusa, que combina sistemas de imagen anatómica por rayos X y de imagen óptica para la visualización de biomarcadores del cáncer.